新規な機能プロテインチップ技術の確立とその臨床応用

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20310121
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 平野 久 Yokohama City University, 生命ナノシステム科学研究科, 教授 (00275075)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川崎 博史 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 准教授 (70169704) ; 荒川 憲昭 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 助教 (60398394)
• Keywords: 翻訳後修飾 / タンパク質 / プロテインチップ / 質量分析装置 / 癌

Research Abstract

これまでにテフロン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド膜など24種類の膜フィルターについて、電気泳動ゲルからのタンパク質を固定化できるか、固定化されたタンパク質を(膜フィルター上でプロテアーゼ消化した後)質量分析装置で効率的に同定できるかどうか調べた。その結果、新規なPVDF-MS膜(仮称)がプロッティングと質量分析装置の両方に使用できることを見いだした。この膜の有用性を検討するため、二次元電気泳動で高分子量および低分子量タンパク質、高等電点および低等電点タンパク質、高濃度タンパク質および低濃度タンパク質など性質の異なる多数のタンパク質を分離し、PVDF-MS膜に転写した。そして、各タンパク質を膜上でトリプシン消化した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF MS)を用いたペプチドマスフィンガープリンティング法によって分析した。その結果、すべてのタンパク質を効率的に同定できることがわかった。本年度は、過ヨウ素酸-シッフ塩基反応(PAS:Periodic-Acid Shiff)染色法によりPVDF-MS膜上で検出された糖鎖修飾タンパク質がMALDI-TOF MSにより同定できるかどうか調べた。まず、糖鎖修飾タンパク質であるトランスフェリンと糖鎖修飾を受けていないウシ血清アルブミンを電気泳動分離後、エレクトロブロッティングによりPVDF-MS膜に転写した。PAS染色法を用いて検出されたバンドを膜フィルター上でトリプシン消化し、MALDI-TOF MSを用いたペプチドマスフィンガープリンティング法により分析した結果、糖鎖修飾タンパク質であるトランスフェリンのみを同定することができた。PVDF-MS膜を用いて糖鎖修飾タンパク質を簡便に分析できると考えられた。

Research Products

• [Journal Article] Co- and post-translational modifications of the 26S proteasome in yeast (2010)
  • Author(s): Kikuchi J, Iwafune Y, Akiyama T, Okayama A, Nakamura H, Arakawa N, Kimura Y, Hirano H
  • Journal Title: Proteomics (in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of receptor proteins using affinity cross-linking with biotinylated ligands (2010)
  • Author(s): Shinya T, Osada T, Desaki Y, Hatamoto M, Yamanaka Y, Hirano H, Takai R, Che F-S, Kaku H, Shibuya N
  • Journal Title: Plant Cell Physiol 51 Pages: 262-270
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transgenic peas expressing an a-amylase inhibitor gene from beans show altered expression and modification of endogenous proteins (2009)
  • Author(s): Islam N, Campbell PM, Higgins TJV, Hirano H, Arkurst RJ
  • Journal Title: Electrophoresis 30 Pages: 1863-1868
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] (2009)
  • Author(s): 平野久
  • Journal Title: タンパク質のアミノ酸配列と翻訳後修飾の分析, やさしい原理からはいるタンパク質化学実験法, タンパク質をみる-構造と挙動-(化学同人, 京都) Pages: 1-32
• [Journal Article] (2009)
  • Author(s): Kamp K, Hirano H
  • Journal Title: N-Terminal sequencing of N-terminally modified proteins. In : The Protein Protocols Handbook(Humana Press, New York) Pages: 1063-1080
• [Journal Article] (2009)
  • Author(s): 木村弥生, 平野久
  • Journal Title: iTRAQ試薬を用いた疾患バイオマーカー探索, 明日を拓く新次元プロテオミクス(秀潤社, 東京, 2009) Pages: 116-121
• [Presentation] Proteome analysis for the discovery of biomarkers and therapeutic targets (2010)
  • Author(s): Hirano H, Arakawa N, Masuishi Y, Morita E, Miyagi E, Hirahara F
  • Organizer: 5th AOHUPO Congress, 14th ADNAT Convention & 1st PSI Conference
  • Place of Presentation: Hydrabad, India
  • Year and Date: 2010-02-24
• [Presentation] 診断マーカーのプロテオミクス, 探索, バリデーション, 利用の方法 (2009)
  • Author(s): 平野久
  • Organizer: 第60回日本電気泳動学会総会
  • Place of Presentation: 松本
  • Year and Date: 2009-09-20
• [Presentation] Proteomic analysis of co- and post-translational modifications in the yeast 26S proteasome (2009)
  • Author(s): 平野久
  • Organizer: 11th International Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins
  • Place of Presentation: Vienna
  • Year and Date: 2009-08-06
• [Presentation] バイオマーカー及び創薬ターゲット探索のプロテオーム研究における質量分析 (2009)
  • Author(s): 平野久
  • Organizer: 第61回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-06-04
• [Presentation] 蛋白質複合体の翻訳後修飾のプロテオーム解祈 (2009)
  • Author(s): 平野久
  • Organizer: 第73日本生化学会中部支部例会・シンポジウム
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2009-05-23