新規な機能プロテインチップ技術の確立とその臨床応用

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20310121
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 平野 久 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 教授 (00275075)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川崎 博史 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 准教授 (70169704) ; 荒川 憲昭 横浜市立大学, 生命ナノシステム科学研究科, 助教 (60398394)
• Keywords: 翻訳後修飾 / タンパク質 / プロテインチップ / 質量分析装置 / 癌

Research Abstract

前年度までに、電気泳動で分離されたタンパク質をゲルから新規なPVDF膜(PVDF-MS膜)に転写(プロット)し、膜フィルター上でプロテアーゼ消化した後、直接、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置(MALDI-TOF MS)でタンパク質を効率的に同定できることを明らかにした。この際、膜フィルターへの効率的な転写と膜フィルター上での効率的な質量分析にはPVDF膜の孔径が重要であった。最終的に、0.1μm孔径のPVDF-MS膜が最も適していると考えられた。この膜フィルターを用いた方法の有用性を検証するため、タンパク質を酵母やヒト卵巣癌培養細胞等から抽出し、二次元電気泳動で分離した。分離された多数のタンパク質をPVDF-MS膜に電気泳動的にプロットし、高密度集積型プロテインチップを作製した。この中から、主にリン酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質など翻訳後修飾されているタンパク質38種類を膜フィルター上でトリプシン消化し、MALDI-TOF/TOF MSによって質量分析を行った。なお、これまで使用したMALDI-TOF MSは、質量分析の精度が十分でなく、再現性の高い結果が得られないことがあった。今年度から、MALDI-TOF/TOF MS(ABサイエックス4800)を用いた。これによって質量分析の再現性を高めることができた。その結果、分析した38種類すべてのタンパク質を高い確度で再現性よく同定することができた。これまでの結果から、電気泳動で分離されたタンパク質を0.1μm孔径のPVDF-MS膜にプロットし、プロットされたタンパク質を膜フィルター上で質量分析装置によって同定する方法は、実用的な技術として利用可能と判断された。

Research Products

• [Journal Article] Proteomic identification of differentially expressed genes in neural stemcells andneurons differentiated f rom embryonic stem cells of cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) in vitro. (2011)
  • Author(s): Akama K, Horikoshi T, Nakayama T, Otsu M, Imaizumi N, Nakamura M, Toda T, Inuma I, Hirano H, Kondo K, Suzuki S, Inoue N
  • Journal Title: Biophys.Biochim.Acta Volume: 1814 Pages: 265-276
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] N^α-Acetylation of yeast ribosomal proteins : Identification by 2D-DIGE MS/MS and analysis of the effect on proteins synthesis. (2011)
  • Author(s): Kamita M, Kimura Y, Ino Y, Kamp R M, Polavoda B, Sherman F, Hirano H
  • Journal Title: Journal of Priteomics Volume: 74 Pages: 431-441
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. (2010)
  • Author(s): Kimura Y, Nagata K, Suzuki N, Yokoyama R, Yamanaka Y, Kitamura H, Hirano H, Ohara O
  • Journal Title: Proteomics Volume: 10 Pages: 3884-3895
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Wild-type p53 enhances Annexin IV gene expression in ovarian clear cell adenocarcinoma.
  • Author(s): Masuishi Y, Arakawa N, Hirano H
  • Journal Title: FEBS J. Volume: (in press)
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Secretome analysis of cell lines derived from ovarian clear cell adenocarcinoma, a highly malignant type of ovarian cancer. (2010)
  • Author(s): Arakawa N, Morita E, Nomura A, Miyagi E, Hirahara F, Kawasaki H, Hirano H
  • Organizer: 9th Human Proteome Organisation World Congress
  • Place of Presentation: Australia, Sydney
  • Year and Date: 20100919-20100923
• [Presentation] ヒト26Sプロテアソームのリン酸化による機能調節 (2010)
  • Author(s): 木村弥生, 永田佳代子, 菅原英俊, 井野洋子, 野村文子, 小原牧, 鵜殿平一郎, 平野久
  • Organizer: 第61回日本電気泳動学会
  • Place of Presentation: 北海道,北海道大学
  • Year and Date: 20100918-20100919
• [Presentation] A novel PVDF membrane for on-membrane identification of gel-resolved proteins by MALDI MS (2010)
  • Author(s): Ino Y, Okayama A, Arakawa N, Hirano H
  • Organizer: The 17th Meeting of Methods in Protein Structure Analysis
  • Place of Presentation: Sweden, Uppsala
  • Year and Date: 20100825-20100828
• [Presentation] 卵巣明細胞腺癌のセクレトーム解析 (2010)
  • Author(s): 荒川憲昭, 森田絵理菜, 宮城悦子, 平原史樹, 平野久
  • Organizer: 日本プロテオーム機構第8回大会・第6回日本臨床プロテオーム研究会連合大会
  • Place of Presentation: 千葉,東京ベイホテル
  • Year and Date: 20100726-20100727
• [Presentation] ヘテロ核リボヌクレオタンパク質のモディフィコミクス (2010)
  • Author(s): 木村弥生, 永田佳代子, 北村浩, 平野久, 小原牧
  • Organizer: 日本プロテオーム機構第8回大会・第6回日本臨床プロテオーム研究会連合大会
  • Place of Presentation: 千葉,東京ベイホテル
  • Year and Date: 20100726-20100727
• [Presentation] 比較リン酸化プロテオーム解析による腫瘍組織型特異的なリン酸化修飾異常蛋白質の探索 (2010)
  • Author(s): 木村鮎子, 野村文子, 永田佳代子, 荒川憲昭, 平野久
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会,第83回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 兵庫,神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2010-12-10