2008 Fiscal Year Annual Research Report
包括的機能研究のためのノックイン胚性幹細胞作製の迅速化と解析
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20310123
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
中山 学 Kazusa DNA Research Institute, ヒトゲノム研究部・ゲノム解析技術研究室, 主任研究員 (30370927)
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| Keywords | 遺伝子 / ゲノム / 機能ゲノム / 動物 / 発生・分化 / バイオテクノロジー / 病態モデル動物 |
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| Research Abstract |
ノックインマウスはマウス個体レベルで蛋白質の機能を解析するために極めて有用な手法である。また、胚性幹(ES)細胞は様々な細胞にIn vitroで分化させることができることから、ノックインマウスを作製するために用いられるだけでなくノックインES細胞自身も有用なバイオリソースとして様々な研究に使用することが可能である。大腸菌内での相同組み換え反応により自由にDNAが改変できるRed/ET組み換えの手法を用いることで蛋白質のC末端部分にタグを付加する形のノックイン作製用のベクターを包括的に迅速に作製するシステムの構築を目指している。更に一度作製したノックインES細胞のタグを別の種類のタグに入れ換える手法の開発も行っている。本年度はノックインベクター構築をRed組み換え反応を用いて迅速に行うために必要なneoカセットとDTAカセットを作製し、2回のRed組み換えでノックインベクターを作製する迅速な方法を確立することができた。また、ノックイン用のタグが自由に変えることの出来るシステムを開発するために、従来は特定の場所にcDNA等の発現ユニットを挿入する方法として開発されたRMCE(Recombinase-Mediated Cassette Exc hange)法をノックインES細胞のタグの入れ換えの手法として用いた。ノックインを行なう蛋白質のC末端部分に交換可能なタグを導入するために、FRTサイトと変異型FRTサイトであるF3サイトを含むノックイン用プラスミドを作製した後、ES細胞に導入し、EGFPタグで検出することができるノックインES細胞を作製した。更にFlp酵素依存的に2種類のDNAの中身を入れ換えることにより、交換効率は低いながらも一度作製したノックインES細胞のタグを正しいフレームで入れ換えることが可能であることを示すことができた。
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