2009 Fiscal Year Annual Research Report
ナノカーボン薄膜電極を用いたメチル化DNA定量デバイスの開発
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20350042
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
丹羽 修 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 生物機能工学研究部門, 副研究部門長 (70392644)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梅村 茂 千葉工業大学, 工学部, 教授 (70316800)
鈴木 孝治 慶応義塾大学, 理工学部, 教授 (80154540)
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| Keywords | 電気化学 / DNA / メチル化 / ナノカーボン薄膜 / オリゴヌクレオチド / シトシン / ECRスパッタ / 酵素 |
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| Research Abstract |
1.実在の長い配列でのメチル化DNAの定量実証
今年度は、実際に疾病に関連するより長いメチルレDNA配列を電気化学的な直接酸化(微分パルスボルタンメトリか矩形波ボルタンメトリを使用)で検出するため、まず電極の表面の電気化学処理を最適化して、13merの配列のシークエンスを繰り返し同じ電極で測定しても電極応答がほとんど低下しないことを確認した。そこで、24merの配列を有し、神経芽細胞腫と言う小児がんの抑制にかかわることが報告されているRB1遺伝子の配列を合成し、その検出を行ったところ、24merの配列で1塩基のシトシンのメチル化の検出に成功した。特に電気化学測定を行う溶媒の組成やpHの検討を行い、最適化によりRB1遺伝子中の1塩基のメチル化シトシンの酸化ピークを他のピークから完全に独立して検出することができた。
次にメチル化の頻度が高いとされているCpGアイランドのシトシンのメチル化率をいくつか変えた試料を用意し、60merの長さのシークエンスで直接酸化に基すく応答を計測したところ、メチル化率とメチルシトシンとのピークに明確なメチル化率依存性が得られ、年度の目標とした33mer以上のシークエンスをもちいてシトシンとメチルシトシンを定量的に測定することに成功した。
2.濃縮による高感度化
将来的なオンチップでの濃縮を考慮し、他研究グループと共同して、いくつかの濃縮法が報告されているキャピラリ電気泳動法での検出を検討した。モノマー単位であるが、シトシンとメチルシトシンの構造が似た塩基の分離が可能なことを示した。
3.メチル化DNA計測チップの予備検討
チップ上で微小試料を高感度に検出するため、微小ディスクアレイ電極をリソグラフィ技術により作製した。ECRスパッタ電極では、金属の電極に比べて生体分子の吸着が少なく、DNAなどの電気化学検出に関して、安定性を保持して使用できる見込みを得た。
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