| Research Abstract |
LC分離の向上と,全く異なる分離手法との組み合わせという2つのコンセプトのもと,現状分離が難しいような配列同士を分離できる,高い分離性能を持つmiRNA分析系の開発をおこなった.まず,現状のLC分離性能の向上を目指し,移動相,移動相の濃度勾配,カラム等,分析条件の最適化を主に行った結果,逆相系のODSカラムで,移動相条件,移動相の濃度勾配を最適化することにより難分離性の類似配列もピークトップ分離できる可能性を示した.続いて,質量分析において,まったく新しい分離モードとして注目されているイオンモビリディースペクトロメーター(IMS)の運用を試みた.IMSは気相中で電気泳動を行う分離装置で,イオンの形,大きさ,電荷により分離されるため,保持時間,質量で分離できない配列の分離が期待された条件を種々検討することにより,難分離性の類似配列をもつ二種のマイクロRNAを分離することに成功した.加えて,本研究では、TaqManプローブを改良した幾種かの新規修飾核酸プローブの設計・合成を行った。これらは、プローブの5'末端に蛍光標識ではなく、イオン化効率の優れた質量タグを修飾し、3'末端にリン酸を付加したものである。このプローブを用いてPCRを行い、DNAポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によって生じた質量タグ+ヌクレオシド1残基を質量分析装置を用いて検出することで、目的の遺伝子を定量的測定が可能であることを確認した。さらに,テーパ状流路を用いたRNAの抽出では、これまでは2次元パターンで流路断面積を変化させていたが、本年度は3次元的に変化させることにより、処理量の大幅な向上を目指した。板に孔を開け、上下から流路で挟む構造で、孔数を増やすことで超並列化も可能である。穴のパターンニングには電子ビーム露光装置を用いた。数値シミュレーションにより電場と流体場を見積もった。3次元流路でもトラップは確認され、ほぼ予想した通りの性能を得た。
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