2009 Fiscal Year Annual Research Report
サーモライシンの食品工業への利用性拡大を目的とした蛋白質工学と反応制御工学
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20380061
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井上 國世 Kyoto University, 農学研究科, 教授 (10223249)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
保川 清 京都大学, 農学研究科, 准教授 (30397559)
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| Keywords | 酵素 / 蛋白質工学 / 反応制御 / ペプチド / 食品 / プロテアーゼ / サーモライシン / 部位特異的変異導入 |
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| Research Abstract |
サーモライシン(TLN)のS1を構成するF114に変異を導入した。正電荷を導入したF114K、F114Rについて、P1サブサイト(P1)に負電荷を有する基質N-carbobenzoxy-D-F methyl ester (ZDFM)分解活性を調べた。F114Kは野生型TLN(WT)の4%、F114Rは10%に低下し、S1-P1間の静電的相互作用はみられなかった。F114を非極性基(A、V、I、L)に置換したところ、カゼイン分解活性はWTと同等であったが、ZDFM分解活性はWTの20%以下、Furylacryloyl-G-L-amide (FAGLA)分解活性は50%以下に減少した。ZDFM分解活性の減少はkcatの低下に起因した。酸化インスリンB鎖を用いてF114変異体の基質特異性を調べたところ、WTと同様であった。S1'を構成するL202に変異を導入した。荷電性基(D、E、R、K)に置換した変異体を用いて酸化インスリンB鎖を分解したところ、WTによる切断個所以外にL-V-C(SO3H)-G-E-R-Gから成るペプチド断片を速やかに分解した。またL202K、L202RはともにZDFM分解活性がWTの3.5倍に増大した。202位に導入した荷電性基がP1'だけでなくP1の荷電性基とも静電的相互作用するものと考えられる。L202をA、Vに置換した変異体について、Furylacryloyl-A-F-amide(FAAFA)、FAGLA、ZDFM分解活性を比較した。これらはWTと比較してP1'残基にLよりもFを好んだ。S1'はポケット構造になっており、その空間を広げることでかさ高いFを認識しやすくなったと考えられる。Sl'を構成する残基に適当な変異を導入することで、荷電性基やサイズの異なる疎水性基の認識を向上させることができた。
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[Journal Article] Gene cloning, bacterial expression, and purification of a novel rice (Oryza sativa L) ubiquitin-related Protein RURM12010
Author(s)
Tsukiyama, T., Lee, J., Okumoto, Y., Teraishi, M., Tanisaka, T., Inouye, K.
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 74
Pages: 430-432
Peer Reviewed
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[Journal Article] The activity of Type II transmembrane serine protease, matriptase, is dependent solely on the catalytic domain, and the stem domain has no significant effect on the activity2009
Author(s)
Kojima, K., Tsuzuki, S., Fushiki, T., Inouye, K.
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Journal Title
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 73
Pages: 454-456
Peer Reviewed
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[Journal Article] Two crystal structures of lysyl-tBNA syntheatase from Bacillus stearothermophilus in complex with lysyladenylate-like compound : Insights into the irreversible formation of the enzyme-bound adenylate of L-lysine hydroxamate2009
Author(s)
Sakurama, H., Takita, T., Mikami, B., Itoh, T., Yasukawa, K., Inouye, K
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Journal Title
Journal of Biochemistry 145
Pages: 555-563
Peer Reviewed
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[Presentation] カテキンの酸化に与える溶存酸素の影響2009
Author(s)
安田みどり, 高瀬武, 田添隆登, 井上國世, 田端正明
Organizer
日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部 日本栄養・食糧学会九州・沖縄支部 日本食品化学工学会西日本支部 2009年度合同沖縄大会
Place of Presentation
琉球大学 千原キャンパス
Year and Date
2009-10-31
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