| Research Abstract |
本研究では, シロサケの未受精卵から単離した3種類のL-ラムノース結合特異性レクチン(RBL), CSL1, CSL2, CSL3によるニジマス由来免疫細胞活性化の分子機構解明と乳病原微生物制御への応用に資することを目的にした。新規ファミリーであるRBLは, いずれも4本のドメイン内SS結合で安定化された約95アミノ酸残基からなる糖鎖認識ドメイン(CRD)が2〜3回タンデムに繰り返された構造からできており. 魚病細菌や原虫病を引き起こす微胞子虫と特異的に結合し, ニジマス腹腔内マクロファージの培養細胞(RTM5)における炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1, IL-8など)や, 抗体産生細胞に働くサイトカイン(IL-11)等の誘導, 食食作用と浩性酸素の生成を誘導した。従来, ゲル濾過カラム担体との非特異的な相互作用のためCSLの正確な分子量測定は困難であったが, 新開発カラムの応用によってCSL1〜3のサブユニット構造を決定し, 多量体形成とレクチン活性の相関を明らかにした。すなわち, これらのRBLは, 4量体, 18量体, 2量体を構成しており, 多量体であるほど強い活性を示した。また, RBLのRTM5における食食作用促進にはCRDが関わっているが, 活性酸素の生成にはRBLのCRD以外の部位が働いていることが分かった。そのため, RBLとその変異体を作威して構造と機能の相関を調べることとし, ベクターpTV118Nと大腸菌JM109を用いて発現系を構築した。発現タンパク質の精製には糖鎖結合活性を基にアフィニティークロマトグラフィーを用いたが宝, 収量が低く, RBLに多く存在するSS結合の正確な巻き戻しが必要であることが分かった。
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