2010 Fiscal Year Annual Research Report
光アフィニティーキャプチャーによるナノモルタンパク質の機能部位解析法開発
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20390032
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
畑中 保丸 富山大学, 医学薬学研究部(薬学), 教授 (30111181)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
友廣 岳則 富山大学, 医学薬学研究部(薬学), 准教授 (70357581)
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| Keywords | 光アフィニティー / 光プローブ / 膜タンパク質 / 機能部位 / 構造解析 / ペルオキシソーム / β-酸化酵素 / ATP |
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| Research Abstract |
タンパク質の構造、とりわけその機能部位の構造解明は創薬・生命科学の進展に欠くことが出来ない。このため、結晶構造解析やNMR構造解析の手法が発展し、これらを支えるタンパク質発現技術も大きく進歩してきた(例えばNature Methods,5,135-146)。しかし一方で、これらの解析に必要な「結晶化」や「安定性」の条件を満たせず、未利用のまま放置される発現完了タンパク質も数多い。本研究では、これらのタンパク質解析へ有効な手段を提供するため、光アフィニティー法に注目し、その効率法開発を目的に検討した。既存の光アフィニティー法は、機能部位ペプチドの配列解析に至るまでには、マイクロモル量の多量タンパク質を必要とするのが通例である。本研究ではこの点の改良に焦点を絞り、膜タンパク質等の発現量の実際的上限とされるナノモル量タンパク質の機能部位解析のための方法確立を課題として設定した。最終年度の平成22年度は、本研究で開発した光プローブを用いてタンパク質機能部位のペプチド配列解析までを検討した。本学薬学部の今中教授と協力し、ペルオキシソームに存在する脂質代謝系のタンパク質に的を絞り、まずビオチンを導入した多機能型パルミチン酸光プローブを合成し、このプローブがβ酸化酵素のperoxisomal multifunctional enzyme type2(MFE2)を特異的にラベルする事を見いだした。ついで、発現MFE2タンパク質を用いてその機能部位解析へと研究を進め、プローブの多機能性を生かしたラベルタンパク質選択的な釣り上げ精製を実施した。この結果、100μg(1.25nmol)のMFE2(80kDa)からTrp249-Arg251の機能部位ペプチド配列を同定し、本研究の目的であるナノモルタンパク質の機能部位解析に成功した。この方法は新規ATPプローブ開発に発展した。
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