2009 Fiscal Year Annual Research Report
新しいDNA損傷検出法による塩基除去修復の細胞周期依存性の解明
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20510054
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
久保 喜平 Osaka Prefecture University, 生命環境科学研究科, 教授 (40117619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松山 聡 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (10254442)
竹中 重雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (10280067)
山本 亮平 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 助教 (20457998)
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| Keywords | 塩基除去修復 / 修復酵素 / RNAi / 放射線 / 化学物質 / shRNA / 脱塩基部位 / 蛍光ARP |
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| Research Abstract |
塩基除去修復(BER)の細胞周期依存性を検討するために、BERの各ステップの酵素のノツクタウン細胞株を前年度に引き続き作製した。
1) polβノックダウン(polB-KD)マウス胎児線維芽細胞(MEF)株の作製。前年度に作製したHela細胞polB-KDに加えて、shRNA法によりpolB-KD MEF株を作製した。この株のpolBタンパクの発現は、野生株の約10%に低下していた。この株を用いた新しい細胞内脱塩基部位検出試薬FARP-1によるメチル化損傷の修復動態の解析は現在進行中である。結果は、polB-KO細胞株におけるそれと比較検討する予定である。
2) in vitroの修復系を再構成するために、BERの最後のステップを担うヒトXRCC1およびDNA Ligase III (Lig3)の相互作用を検討するために、それらの発現系を構築した。Lig3は、N末端側の48アミノ酸殘基を欠くバリアント(Lig3Δ48)が得られた。Lig3Δ48は、活性にATPを要求し、XRCC1の共存下で、約40%の活性増強を示した。
3) shRNAiによるXRCC1ノックダウンHeLa細胞株を作製した。XRCC1-KD細胞は、野生株の約60%のXRCC1タンパク発現を示したが、MMSに対する生残率は、1.5mM以上で有意な低下を示した。
4) shRNAiによるAPE1-KD細胞株は現在作成中である。
5) FEN-1-KD細胞株を含めたこれらのKD細胞を用いて、BERの細胞周期依存性を検討中である。
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