2009 Fiscal Year Annual Research Report
抗イモチ病用カスガマイシンの大腸菌による発酵生産と新規ハイブリッド抗生物質の創製
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20580081
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
小嶋 郁夫 Akita Prefectural University, 生物資源科学部, 教授 (90315581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上松 仁 秋田工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (20435407)
春日 和 秋田県立大学, 生物資料科学部, 助教 (40315594)
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| Keywords | 抗生物質生産 / 代謝工学 |
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| Research Abstract |
【1】 放線菌・大腸菌で恒常的にカスガマイシン(KSM)生産を導く生合成遺伝子カセットの構築
Streptomyces kasugaensis由来のKSM生合成(kas)遺伝子クラスターを用いて,各kas遺伝子の上流に高効率のRBSを付加し,さらにKSM推定生合成経路に従って4種のモジュールに再編成した。さらに4種のモジュールを大腸菌・放線菌で高活性を示すプロモーターPdbfBまたはPneoに連結した。一方,KSM構成糖のmyo-イノシトールの生合成遺伝子inolをS.avermitilisよりクローン化して,Pneoによる強制発現ユニットを構築した。このようにして作製した4種のkas遺伝子群モジュールとinol発現ユニットについて,これらのプロモーターのPdbfBないしPneoが同方向に多重連結しないように配置して連結したKSM生合成遺伝子カセットを構築した。しかし,本カセットで形質転換した大腸菌およびS.lividansはいずれもKSMを生産せず,機能未知としてモジュールから除外したkasBないしkasOがKSM生合成に関与していることが示唆された。
【2】 ミノサミノマイシン(MSM)とKSMとのハイブリッド物質の生産
MSMはKSMの構造類似体で,Mycobacterium smegmatisに抗菌活性を示す抗生物質である。MSMとKSMのハイブリッド物質の生産をめざし,異種放線菌でKSM生合成を導くKSM生合成プラスミド(平成20年度に構築)をMSM生産菌Streptomyces sp.MA514-A1の染色体へ導入した。その結果,導入株はPseudomonas fluorescensのKSM高度感受性変異株およびM.smegmatisの2菌株に顕著な抗菌活性を示す物質を生産した。一方,導入株の培養液のHPLC分析からはKSMは検出されなかった。現在,抗菌活性の原因物質について,培養液の機器分析により解析を進めている。
【3】 MSM生合成遺伝子群のクローニング
MSM生合成遺伝子クラスターのクローン化をめざし,MSM生産菌MA514-A1株のゲノムより,kasR(S.kasugaensisのカスガミン生合成遺伝子)およびendP(S.fungicidicusのenduracididine生合成遺伝子)の相同遺伝子の一部をクローン化して,これらの塩基配列を基にPCRプライマーを設計した。MboI部分消化物(約40kb)よりなるMA514-A1株のコスミドゲノムライブラリーに対してこれらプライマーを用いてcolony-direct PCRを行い,kasRおよびendP相同領域の両方を含む約31および38kbの2種のクローン化DNA断片を得た。
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