ニホンウズラ二おける自然免疫に関与する受容体と抗菌ペプチドの発現

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20580327
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 原 ひろみ Tokyo University of Agriculture, 農学部, 講師 (00343567)
• Keywords: ニホンウズラ / TLR4 / TLR2 / mRNA / 正常血漿IgG濃度

Research Abstract

1.TLRおよびDEFB遺伝子の解析
1)DEFBおよびTLR2mRNA転写の有無本年度はDEFBについてmRNA転写の有無は確認できなかった。
TLR2:TLR2type1およびtype2特異配列を挟むように共通塩基配列領域でプライマーを設計し、このプライマーを用いてニホンウズラ1、3、5および7日齢の正常血漿IgG値の高いCjA系と低いCjB系各3個体の空腸、回腸、盲腸および結腸由来cDNAをテンプレートにPCR増幅し、アガロースゲル電気泳動にて産物を確認した。
TLR4:ニワトリTLR4(AY064697)のエキソン2〜3領域を増幅するプライマーを設計し、ニホンウズラのコスミドゲノムライブラリー作製個体のグノムDNAをテンプレートにPCR増幅し、得られた産物からプローブを調整し、コロニーハイブリダイゼーション法にてニホンウズラのコスミドゲノムライブラリーをスクリーニングした。得られたライブラリーより1つをTLR4陽性クローンとして選択した。そのクローンについて、 TLR4特異的プライマーによるPCR増幅、シークエンス解析した。ニホンウズラゲノムライブラリーより選択したクローンにはPCR増幅、シークエンス解析よりニワトリのexon1-3に相同の塩基配列が含まれていることを確認し、さらにそのクローンよりニワトリTLR4遺伝子(ll,700bp)の72%の領域に相当するニホンウズラTLR4の8,439bpを決定した。 Exon3領域内を増幅するブライマーを設計し、4週齢ニホンウズラの18臓器由来cDNAをテンプレートに発現の有無を確認した。
2.解析ツールとしての抗体作製
1)DEFB2および12特異的抗体作製抗DEFB2抗体作製では選択したエピトープである合成ペプチドに対して抗体価の上昇が認められず、エピトープを再選択の必要性が考えられた。
抗TLR2type共通ペプチド抗体を用いてニホンウズラ4週齢の腸管:十二指腸、回腸、空腸、盲腸、結腸、およびリンパ臓器:胸腺、脾臓、ファブリシウス嚢、盲腸扁桃を免疫組織染色した。各臓器内で散在するリンパ球および集族リンパ球、濾胞内リンパ球および上皮性細胞が強い陽性を示した。
Type特異的な抗体作製には至らなかった。