| Research Abstract |
イノシトール燐脂質(PIs)は種々の細胞現象に関与することが報告されており,特にPI(4,5)P_2はシグナル伝達,小胞輸送,細胞骨格制御など関与する現象は多岐にわたる.同一分子が異なる機能を制御するためには,局所的にPI(4,5)P_2の量が緻密に制御されていると推測されているが,その詳細は明らかでない.PIsの局在は,PIs結合ドメインとGFPの融合蛋白質によるイメージングで解析されてきたが,この方法では空間分解能が低く二次元的分布の詳細な情報は得られない.一方,通常の免疫電顕法では化学固定できない脂質の局在を正確に決定することは困難である.そこで我々は凍結割断レプリカを用いて,PI(4,5)P_2の超微局在を検索する方法を開発した.凍結割断レプリカでは細胞膜分子は白金・カーボンの薄膜で物理的に固定されるため,生細胞での分子分布が超微形態レベルで維持される.本研究ではPI(4,5)P_2に特異的に結合するPLCδ1のPHドメインとGSTの融合蛋白質でレプリカを標識し,細胞膜上での二次元的分布を解析した.ヒト線維芽細胞の細胞膜では,PI(4,5)P_2標識はカベオラ開口部およびコーテッドピット周囲に集中する傾向が見られ,標識密度は平坦な領域に比べ有意に高かった.またangiotensin II(Ang II)刺激によって細胞膜のPI(4,5)P_2の量が減少し,平坦な領域の方がカベオラ開口部よりも早い段階で減少することがわかった.これに対しコーテッドピット周囲での集積はAng II刺激によって変化しなかった.さらに,ionomycinによっては逆にカベオラ開口部の方が平坦な領域の方よりも早い段階で減少することから,少なくとも細胞膜には3つの異なったPI(4,5)P_2のプールが存在することがわかった.このように凍結割断レプリカ標識法を用いることにより,PI(4,5)P_2のナノスケールレベルでの局在を検討できることが示された.
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