表皮幹細胞と羊膜を利用した三次元培養皮膚の簡便大量作製法の開発

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591347
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 Ehime University, 総合科学研究支援センター, 講師 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白方 裕司 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (50226320)
• Keywords: 表皮幹細胞 / SP細胞 / セルソーター

Research Abstract

今年度は、SP細胞を利用したヒト表皮幹細胞を中心に検討を行った。すなわち、手術時の余剰ヒト皮膚をディスパーゼにて剥離し、トリプシン処理によって細胞を分離した。その後、ヘキスト33342にて細胞を染色し、セルソーター(Aria、ベクトンディッキンソン)を使って、ヘキストブルー、ヘキストレッド両陰性の分画を無菌的にソーティングし、まだ、生存率は良くないが、染色の条件等は、マウスの条件に準じた条件で良いことが明らかになった。同時に、ベラパミル処理した細胞で、この分画が消失することを確認することもできた。すなわち、ベラパミル消失することがside populationであることの証明になるとされている。来年度は、細胞障害の影響を考え、よりマイルドな条件での細胞分離の条件および培養条件を検討する必要があると思われる。また、無菌的に分離した細胞の無血清培地での培養も検討している。従来はb1インテグリン、a6インテグリンの強発現細胞が幹細胞としてのマーカーであるとされており、SP細胞がこのマーカーをどの程度発現しているかについて、二重染色を行っているが、まだ有意な差は見られていない。さらに、条件を検討する必要があると思われる。三次元培養皮膚作製時での羊膜併用の効果は、ブタ腱由来I型コラーゲン液に線維芽細胞を加えてカルチャーインサートに添加し、ゲル化を行って、免疫染色にて基底膜構成成分(ラミニン5,IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、α6β4インテグリン)、細胞間接着因子(Eカドヘリン、デスモグレイン1,3,α2インテグリン)、細胞骨格(ケラチン5,14,I,10)、分化マーカー(インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ)などの発現は、現在、検討中である。