表皮幹細胞と羊膜を利用した三次元培養皮膚の簡便大量作製法の開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591347
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 亀田 健治 Ehime University, 総合科学研究支援センター, 講師 (60363264)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白方 裕司 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (50226320)
• Keywords: 表皮幹細胞 / 羊膜 / SP細胞 / セルソーター / 三次元培養

Research Abstract

ヘキスト33342により細胞染色し、セルソーターにてヘキストブルー陰性・ヘキストレッド陰性の分画、いわゆるSP細胞解析を行った。すなわち、ヘキスト33342の濃度、反応時間、染色法についての条件を検討し、フローサイトメーターの設定条件、また、セルソーターの機器設定など最終条件の確認ができた。今後、最適な培養液、培養ディッシュ、細胞外マトリクスを検討し、SP細胞を効率よくかつ確実に培養できるシステムを構築する。羊膜の保存においては、グリセロールを50%含むPBSにて凍結保存、凍結乾燥したもの(ガンマ線滅菌すみ)、さらに凍結乾燥の際に膜機能保持剤を添加(ガンマ線滅菌ずみ)の条件において最適条件の設定を行っているがまだ最終確認はできていない。三次元皮膚培養における詳細な条件は、まだ継続実験中であるが、来年度中には、条件設定が完了する予定である。コラーゲンゲルを用いた場合と用いない場合では、まだ優位な差は見られないが、今後、詳細に検討する必要があると思われる。重層化の際に使用する動物由来物質を含まない培養法はほぼ確立した。また、重層化の際に使用する培養液の血清をヒト血清に置き換えて、動物由来物質を含まない培養液での培養法の条件設定もほぼ最終段階になっている。HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にてよる検討、すなわち、HE染色にて形態学的な特徴を解析し、免疫染色にて基底膜構成成分(ラミニン5,IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、α6β4インテグリン)、細胞間接着因子(Eカドヘリン、デスモグレイン1,3,α2インテグリン)、紐胞骨格(ケラチン5,14,1,10)、分化マーカー(インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ)などの発現を比較検討、さらに電子顕微鏡での検討は、現在進行中である。