肝移植後肝癌再発に対する核酸シャペロンを用いた新規IL-12遺伝子治療の開発

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591528
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 副島 雄二 Kyushu University, 大学病院, 助教 (30325526)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前原 喜彦 九州大学, 医学研究院, 教授 (80165662) ; 武冨 紹信 九州大学, 大学病院, 助教 (70363364) ; 吉住 朋晴 九州大学, 大学病院, 特別教員 (80363373)
• Keywords: インターロイキン12 / ヒアルロン酸くし型共重合体 / 遺伝子治療

Research Abstract

1.IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1,BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12p40cDNAと1260bpのIL12p35cDNAを挿入したプラスミドが当科にて実験系にて使用され、その効果が確認されている。このプラスミドを用いE.coli JM109 competent cellを形質転換し、LB培地にて大量培養後、QIAGEN Mega kitを用いプラスミドを精製・回収し、その純度(0.D.260/280)が1.9以上である事を確認した。さらに、Hindlll、EcoR1にて酵素処理後、アガロールゲルにて電気泳動し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。
2.PLL-g-HAの精製:共同研究施設である、九州大学先導物質科学研究所丸山研究室にて精製。高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。水酸化シアノほう素ナトリウム(NaBH_3CN)を還元剤とし、0.1MpH8.0のホウ酸ナトリウムバッファー内にてビアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、恒温撹拌槽(40度)にて5日間処理した後、限外濾過(MWCO:25000)にて重合できなかったピアルロン酸を取り除いた。さらに凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。
3.PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl 10mM PBS(-)(ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5,1,2,3,4,5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。更に30分間のインキュベーションを行い重合反応とした。アガロースゲルにて電気泳動し、プラスミドのバンド消失をもって重合の確認とした。N/P比=0.5よりバンドの消失が認められ、N/P比=3にて完全なるバンドの消失を認めた。