肝移植後肝癌再発に対する核酸シャペロンを用いた新規IL-12遺伝子治療の開発

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591528
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 副島 雄二 Kyushu University, 大学病院, 助教 (30325526)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前原 喜彦 九州大学, 医学研究院, 教授 (80165662) ; 武冨 紹信 九州大学, 大学病院, 助教 (70363364)
• Keywords: インターロイキン12 / ヒアルロン酸くし型共重合体 / 遺伝子治療

Research Abstract

1. IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1, BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12 p40 cDNAと1260bpのIL-12 p35 cDNAを挿入したプラスミドが当科にて実験系にて使用され、その効果が確認されている。このプラスミドを用いE. coli JM109 competent cellを形質転換し、LB培地にて大量培養後、QIAGEN Mega kitを用いプラスミドを精製・回収し、その純度(O.D. 260/280)が1.9以上である事を確認した。さらに、HindIII、EcoR1にて酵素処理後、アガロールゲルにて電気泳動し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。
2. PLL-g-HAの精製:共同研究施設である、九州大学先導物質科学研究所丸山研究室にて精製。高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。水酸化シアノほう素ナトリウム(NaBH_3CN)を還元剤とし、0.1M pH8.0のホウ酸ナトリウムバッファー内にてヒアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、恒温撹拌槽(40度)にて5日間処理した後、限外濾過(MWCO:25000)にて重合できなかったピアルロン酸を取り除いた。さらに凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。
3. PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl 10mM PBS(-)(ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5, 1, 2, 3, 4, 5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。更に30分間のインキュベーションを行い重合反応とした。アガロースゲルにて電気泳動し、プラスミドのバンド消失をもって重合の確認とした。N/P比=0.5よりバンドの消失が認められ、N/P比=3にて完全なるバンドの消失を認めた。

Research Products

• [Journal Article] The use of autologous vena cava patch graft for reconstructing multiple outflow orifices in right hemiliver living donor graft (2009)
  • Author(s): Ikegami T, Soejima Y, Nagata S, Taketomi A, Maehara Y.
  • Journal Title: Transplant Int 22 Pages: 853-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hypersplenism after living donor liver transplantation (2009)
  • Author(s): Ikegami T, Soejima Y, Taketomi A, Kawanaka H, Yoshizumi T, Shimada M, Maehara Y.
  • Journal Title: Hepatogastroenterology 56 Pages: 778-82
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recurrent familial hypobetalipoproteinemia-induced nonalcoholic fatty liver disease after living donor liver transplantation (2009)
  • Author(s): Harada N, Soejima Y, Taketomi A, Yoshizumi T, Uchiyama H, Ikegami T, Saibara T, Nishizaki T, Maehara Y.
  • Journal Title: Liver Transpl 15 Pages: 806-9
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 生体肝移植における摘出肝門脈及び内頚静脈グラフトを用いた血行再建手技とその応用 (2009)
  • Author(s): 副島雄二, 武冨紹信, 内山秀昭, 池上徹, 二宮瑞樹, 萱島寛人, 森田和豊, 戸島剛男, 武石一樹, 本村貴志, 前原喜彦
  • Organizer: 第21回日本肝胆膵外科学会
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 20090610-20090612
• [Book] 肝移植四半世紀の歩み (2009)
  • Author(s): 副島雄二, 前原喜彦
  • Total Pages: 78
  • Publisher: 九州大学における肝移植のあゆみ