2008 Fiscal Year Annual Research Report
新規表面抗原の同定に基づくマウス肝幹細胞の分離および特性解析
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20591610
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
安近 健太郎 Kyoto University, 医学研究科, 助教 (00378895)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
猪飼 伊和夫 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60263084)
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449)
石井 隆道 京都大学, 再生医科学研究所, 研究員 (70456789)
加茂 直子 京都大学, 医学研究科, 医員 (50452355)
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| Keywords | 肝幹細胞 / 表面抗原 |
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| Research Abstract |
マウス肝幹細胞特異的遺伝子候補の選別
1)マウス肝前駆/幹細胞分画の分離。
我々が上記の先行研究においてすでに確立した方法に基づき、全身にgreen fluorescent protein(GFP)を発現する遺伝子改変マウスより蛍光励起セルソーター(FACS Vantage SE)を利用して、マウス成体肝臓由来肝前駆/幹細胞分画を分離した。また、同時に成熟肝細胞分画を分離し、同一個体より肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画とを分離した。
2)肝幹細胞特異的発現遺伝子のスクリーニング
上記のようにして同一個体より分離した肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画のそれぞれよりmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製したうえで、DNAサブトラクション解析を施行し、肝前駆/幹細胞分画に特異的に発現する36個の遺伝子候補を選別した(一次スクリーニング)。選別した候補遺伝子の中から蛍光励起セルソーターによる細胞分離に利用可能な細胞表面抗原遺伝子に焦点を絞り、genome infomaticsの情報を利用して、膜貫通ドメインを持つ24個の候補遺伝子をさらに選び出した。その上で、各候補遺伝子に対してPCR primerを設定し、改めて分離した肝前駆/幹細胞細胞分画に対してRT-PCRを行い、実際に遺伝子発現を確認した(二次スクリーニング)。さらに、肝前駆/幹細胞分画より発現蛋白質を抽出し、二次元電気泳動により発現遺伝子のタンパク発現を確認する(三次スクリーニング)。こうして肝幹細胞特異的発現遺伝子候補を6個に絞り込んだ。
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