2008 Fiscal Year Annual Research Report
ポロソームに焦点をあてた分泌機構抑制による機能性下垂体腺腫の新しい治療法の確立
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20591723
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
松野 彰 Teikyo University, 医学部, 教授 (00242058)
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| Keywords | EYFP-GH / porosome / VAMP / fodrin |
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| Research Abstract |
我々がさきに確立したEYFPとGHとの融合蛋白(EYFP-GH)の遺伝子を発現する、ラット由来の下垂体培養細胞のstable cell line (GH3 cellとAtT-20 cell)において、porosomeの存在を原子間力顕微鏡(走査型プローブ顕微鏡)を用いて確認した。ついで、porosomeの分泌顆粒側の構成因子であるVAMPと介在分子であるfodrinに焦点をあて、VAMPとECFPの融合蛋白、およびfodrinとEGFPの融合蛋白を強制発現させ、共焦顕微鏡下に観察し、これらの分子がporosomeの形成機構とGHの分泌に必須であることを確認した。ラットVAMPのcDNAについてはラット下垂体組織よりmRNAを抽出し、RT-PCRにより作製した。VAMPのcDNAに対して制限酵素サイトをPCRに付加し組換えを行い、ECFPと融合させた。このVAMPとECFPの融合蛋白の組換え遺伝子を、EYFP-GHの遺伝子を発現する、ラット由来の下垂体培養細胞のstable cell line(GH3 cellとAtT-20 cell)に導入した。トランスフェクションは、Trans ITTMなどを用いて行った。EYFP-GHとECFP-VAMPについて生物学的免疫学的特性に変化がないことをWestern blottingや細胞培養を用いて確認した。fodrinについても同様にEGFPとの融合蛋白の組換え遺伝子を作製し、EYFP-GHの遺伝子を発現する、ラット由来の下垂体培養細胞のstable cell line(GH3 cellとAtT-20 cell)に導入した。
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