蝸牛有毛細胞の再生に関わる支持細胞の分裂・増殖・分化とアポトーシスの機構の解明

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591973
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 鈴木 光也 Toho University, 医学部, 教授 (50302724)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山岨 達也 東京大学, 医学部付属病院, 教授 (60251302) ; 坂本 幸士 東京大学, 医学部付属病院, 特任講師 (50323548) ; 樫尾 明憲 東京大学, 医学部付属病院, 助教 (20451809)
• Keywords: 未成熟ラット / 蝸牛 / BrdU / 支持細胞 / 分裂 / ネオマイシン

Research Abstract

1)未成熟ラット(生後7日目)の蝸牛を摘出し、surface preparation techniqueを用いてコルチ器を分離後、ネオマイシン1mMを含んだ培養液中に浸漬し、5日間組織培養を行った。培養5日目に10%ホルマリンで固定し、その後Triton Xで処理した後にRhodamin Phalloidin染色を行い、蛍光顕微鏡にて有毛細胞と支持細胞の状態を観察した。(結果)外有毛細胞領域に数多くのscar formationが観察された。このことより組織培養条件下に1mMネオマイシンを投与した場合、投与5日目には外有毛細胞が高度に傷害されることが明らかとなった。アミノグリコシドを用いた我々の先行研究の結果と考え合わせると、組織培養条件下の1mMネオマイシンを投与では外有毛細胞のアポトーシスは投与2日目には始まることが推察された。
2)有毛細胞障害後の支持細胞分裂の観察
支持細胞から有毛細胞への分化誘導の前段階と考えられる支持細胞の分裂状態を観察することを目的とした。生後7日目ラットの蝸牛を摘出した後、上記研究と同様の操作を行ってネオマイシン1mMを含んだ培養液中に浸漬し、5日間組織培養を行った。有毛細胞傷害後の支持細胞の分裂・増殖の状態を観察するために、培養2日日からはBrdU 1mg/Lを培養液中に混入させた。10%ホルマリン固定後、surface preparation techniqueを用いて標本を作製し、抗BrdU抗体を用いて免疫染色を行って支持細胞内のBrdUの取り込み状況を観祭したところ、BrdUが取り込まれた細胞を確認することができたが、その細胞が支持細胞かどうかを判断するのは困難であった。現在は培養したコルチ器をパラフィン包埋し薄切片を作成し、抗BrdU抗体を用いて免疫染色で取り込み状況を観察中である。