細菌性中耳炎における中耳粘膜肥厚の分子制御の解明とその治療

2010 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20591992
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 古川 正幸 順天堂大学, 医学部, 准教授 (20359524)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池田 勝久 順天堂大学, 医学部, 教授 (70159614) ; 楠 威志 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30248025) ; 横井 秀格 順天堂大学, 医学部, 准教授 (80317487)
• Keywords: DNA microarray / 中耳粘膜肥厚 / 中耳炎

Research Abstract

研究にはマウス中耳炎モデル動物(Mouse models of induced otitis media. Ryan AF, Ebmeyer J, Furukawa M, Pak K, Melhus Å, Wasserman S, Chung W-H. Brain Res. 26;1091(1):3-8,2006).を用いた。マウスに手術を施行し、右中耳にHaemophilus influenzae10^5個を注入した。Haemophilus influenzaeに感染したマウス中耳粘膜を時間経過(3h、6h、24h)で3グループに分けた。対照はHaemophilus influenzaeではなくPBSを注入した左中耳を用いた。対照も時間経過(3h、6h、24h)で3グループに分けた。時間経過(3h、6h、24h)で3グループに分けた中耳粘膜を摘出して試料とした。組織は-80℃に保存し、一部はパラホルムアルデハイドで固定し、OCT compoundで包埋した。Haemophilus influenzaeに感染した中耳粘膜および正常中耳粘膜より抽出したmRNAから、逆転写酵素にてcDNAを合成し、蛍光標識した。これをDNA arrayerによって作成したarrayに反応させ、hybridizationしたcDNAの有無をDNA array scannerを用いて検出した。これにより15,000の遺伝子発現を一度に解析し、候補遺伝子を検索した。候補遺伝子のmRNA量はリアルタイムPCRによって定量した。mRNAを試料から抽出し、特異的な塩基配列を有するプライマーを作成した。TaqMan PCRキットを用いて伸張反応でDNAポリメラーゼがプローブを分解し、その結果生成されたレポーター色素の蛍光強度をABI Prism 7700にて定量的に測定した。55,000の遺伝子発現をこれまで解析した。結果はHaemophilus influenzaeに感染したマウス中耳粘膜とPBSを注入したマウス中耳粘膜を時間経過(3h、6h、24h)で比較すると、3hでは発現が上昇している遺伝子群は513であり、発現が低下している遺伝子群はわずか2であった。6hでは発現が上昇している遺伝子群は658であり、発現が低下している遺伝子群は188であった。24hでは発現が上昇している遺伝子群は1350であり、発現が低下している遺伝子群は1632であった。