2009 Fiscal Year Annual Research Report
変性タンパク質の可溶化技術を活用した細胞内イメージング技術の開発
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20650070
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
山田 秀徳 Okayama University, 大学院・自然科学研究科, 教授 (80037613)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
二見 淳一郎 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 准教授 (00420498)
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| Keywords | バイオテクノロジー / 生物・生体工学 / 蛋白質 / 細胞内イメージング / 化学修飾 / 細胞・組織 / ケミカルバイオロジー / 巻き戻し |
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| Research Abstract |
(1) N末端特異的な蛍光標識による高精細な細胞内イメージング
平成20年度に細胞内イメージングのモデルタンパク質としてN末端特異的に蛍光基を標識したβアクチンタンパク質を可逆的変性カチオン化法により高い水溶性を保持した蛍光標識プローブを調製することに成功していた。本年度はマイクロインジェクション法で細胞内への注入を試みたが、培地中で蛍光標識プローブが重合しやすく極めて困難であった。そこで蛍光標識プローブの溶解度向上に向けた諸条件を検討した結果、新規カチオン化試薬:TAP3S-Sulfonateの利用で高い溶解性が得られた。また、逆相HPLCで高純度に精製することで、純水および生理食塩水中で高い溶解度を維持できることを見出し、本手法に適した蛍光標識プローブの調製方法を確立した。
(2) 細胞内分泌経路のイメージングに関する技術開発
可逆的変性カチオン化により可溶化した分泌シグナル付きの前駆体の酵素タンパク質を生細胞内に導入すると、一部が培養上清中に活性構造の成熟型の酵素タンパク質が再分泌されることを酵素活性レベルで確認していたが、その収量はごく微量であった。この効率を改善するため、エンドソームから細胞質内への放出を促進する両親媒性ペプチドの併用条件を検討し、再分泌量が大幅に向上する条件を得た。さらにこの手法で回収された成熟型タンパク質を逆相HPLCを用いて高度に精製し、N末端配列を確認したところ、正しくプロセッシングを受けていることが確認され、翻訳系を伴わないpost-translational経路によるタンパク質の成熟化が可能なことを立証できた。
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