2008 Fiscal Year Annual Research Report
1残基のアミノ酸置換で「糖質分解酵素を多糖合成酵素に変換」する現象の分子機構
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20658025
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
木村 淳夫 Hokkaido University, 大学院・農学研究院, 教授 (90186312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥山 正幸 北海道大学, 大学院・農学研究院, 助教 (00344490)
森 春英 北海道大学, 大学院・農学研究院, 准教授 (80241363)
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| Keywords | アミノ酸置換 / 糖質分解酵素 / 多糖合成酵素 |
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| Research Abstract |
1残基のアミノ酸置換で「多糖の加水分解酵素(デキストナーゼ)を合成酵素に転換できる現象」を見出した。この反応機構を分子解析することが、本申請の目的である。このような合成反応は例がなく、世界で初めての現象である。また、産業利用への発展にも期待したい。この残基は触媒アミノ酸と考えられる。本現象は試験管内の観察であるが、このような点突然変異した酵素が実際に生物で機能している可能性を得た。進化の過程においてアミノ酸置換は容易に生じ、1つのアミノ酸を変異させることで酵素分子を「加水分解→合成」にする戦略は、進化的に効率が良い。この戦略の検証も本申請の目的に加えたい。計画は順調に進行しており、次の結果を得た。
多糖合成の分子解析(デキストナーゼ) : 1)酵素の結晶化 : 親酵素とGly置換体を精製し、結晶化を行っている。2)基本的な反応条件の確立 : 反応にN_3^-が関与するので、予めN_3^-の充足濃度を求めた。また、Gly置換で生じた活性中心の空間に侵入できない「大きなサイズの陰イオン」を成分とする緩衝液を選抜した。3)反応因子の解析 : 本合成反応の至適pHおよびpHや温度に対する安定領域を求めた。得られた反応条件において動的解析を行った。
触媒残基の変異酵素の解析(ウニ酵素) 4)遺伝子の発現 : ウニから構築したcDNAライブラリーを鋳型に、特異的DNAプライマーを用いたPCR法で酵素遺伝子を単離した。酵素遺伝子の異種宿主発現(大腸菌や酵母の系)を行っている。
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