2008 Fiscal Year Annual Research Report
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20658026
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
日出間 志寿 Tohoku University, 大学院・農学研究科, 助手 (30241558)
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| Keywords | 細胞透過性ペプチド / 転写因子 / 細胞分化 / MyoD |
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| Research Abstract |
PTD(Protein Transduction Domain)配列を目的の転写因子に付加することによって生細胞に効率よく導入し安全で確実な細胞分化系を確立することを目的とする。PTD-Tat-MyoDについて最適な蛋白発現、精製系を確立した。MyoDはbHLHモチーフをもつ骨格筋細胞分化に必須の転写因子で, 標的DNA配列であるE-Boxに結合する。作製したPTD-Tat-MyoDが転写因子の性質を保持しているか否かの一指標として標的DNA配列をプローブに用いてPTD-Tat-MyoDの結合をゲルシフトアッセイにて検証した。PTD-Tat-MyoDを導入する細胞はマウスの間葉系幹細胞由来の10T1/2とする。これらはトランスフェクションや脱メチル化剤によって筋管細胞に分化することが報告されている^<2, 3, 4)>。Luciferase repoter assayにより添加したPTD-Tat-MyoDが上記の細胞内に導入されかっ標的DNA配列に結合し下流遺伝子の転写を活性化することを見いだした。マウス間葉系幹細胞C3H10T1/2にPTD-Tat-MyoDと、単独では分化を誘導しない低濃度の5アザシチジンを加えたところC3H10T1/2の一部が筋管細胞に分化したことを示した。今後、PTD-Tat-MyoDを加えるタイミングや濃度を検討しさらに高頻度に筋管細胞に分化する系を確立する。繊維芽細胞が骨格筋系の細胞に分化する際MyoDによってMyogenin, Desmin, Myosin light chain, Muscle creatine kinaseなどの転写が活性化されることが報告されている。よってそれらの発現をPTD-Tat-MyoDをC3H10T1/2やMEFに添加する前後でRT-PCR, タンパク産物のWestern blot解析、細胞を間接抗体染色、FACS解析などで比較する。
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