2008 Fiscal Year Annual Research Report
新規蛍光プローブを用いたG蛋白質共役型脂肪酸受容体ファミリー活性化機構の解析
| Project/Area Number |
20659011
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
平澤 明 Kyoto University, 薬学研究科, 准教授 (70242633)
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| Keywords | GPCR / 蛍光プローブ / 脂肪酸受容体 |
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| Research Abstract |
【脂肪酸受容体大量発現系の構築】
脂肪酸受容体ファミリーそれぞれについて、大量発現が期待される昆虫細胞発現系および、生理的な調節機構の解明が期待される動物細胞での誘導発現系を構築した。
【脂肪酸受容体特異的な蛍光プローブの開発とフローサイトメトリーを用いた結合実験】
脂肪酸のアルキル鎖中に蛍光発色団としてBODIPYを挿入した構造の多種の化合物が市販されている。その中から蛍光プローブとして機能する化合物をスクリーニングした。受容体を大量発現した細胞に上記化合物を各種濃度で添加後、フローサイトメトリーで細胞の蛍光検出、結合の解析を行い、蛍光プローブとしての評価を行った。より詳細な受容体の結合実験にはビーズ上に固定した受容体と蛍光プローブを用いた相互作用の解析を行った。昆虫細胞発現系を用いて、受容体のN末端にFLAGタグを結合させた各脂肪酸受容体の発現系を構築した。得られた脂肪酸受容体発現細胞を可溶化し、抗FLAG抗体及びprotein G修飾されたビーズを用いて免疫沈降を行い、ビーズ脂肪酸受容体複合体を得た。この複合体に対して、上記の各脂肪酸の蛍光プローブを添加し、受容体に結合したプローブからの蛍光をフローサイトメトリーを用いて検出できた。この結合は受容体蛋白質存在下でのみ検出され、蛍光ブロー部濃度に対して飽和生を有し、また可逆的であった。さらに脂肪酸およびリガンドであることが報告されているMEDICA16等の化合物で特異的阻害が認められた。この実験系により、リガンドに対して低親和性の受容体について相互作用の解析手法が確立できた。
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[Journal Article] Synthesis and application of fluorescein-and biotin-labeled molecular probes for the chemokine receptor CXCR4.2008
Author(s)
Oishi S, Masuda R, Evans B, Ueda S, Goto Y, Ohno H, Hirasawa A, Tsujimoto G, Wang Z, Peiper S C, Naito T, Kodaraa E, Matsuoka M, Fujii N.
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Journal Title
Chembiochem. 9(7)
Pages: 1154-1158
Peer Reviewed
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[Presentation] FAT SENSING IN THE GUT2008
Author(s)
Akira Hirasawa, Gozoh Tsujimoto
Organizer
THE 18TH EUROPEAN CHEMORECEPTION RESEARCH ORGANIZATION CONGRESS, ECRO-2008
Place of Presentation
Grand Hotel Bernardin, Portoroz, Slovenia
Year and Date
2008-09-04
