| Research Abstract |
骨芽細胞分化に機能するmiRNAを同定するために, C2C12細胞にBMP-2を加えRNAを回収し, Step-Oneを用いてリアルタイムPCRを行った. BMP-2によりmiR-1,-133a,-206の発現が経時的に減少することが明らかになった. これらの減少が転写の抑制によるものかどうか調べるためpri-miRの発現量をRT-PCR法により調べた. BMP-2によりpri-miR-206の発現量が増加していたことから, miR-206の発現低下は転写レベルではなく, 転写後の成熟過程における抑制と考えられた. miR-206をアンチセンスRNAによってノックダウンさせたが, miR-1の発現量は代償的な変化は認められなかった. TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを骨髄間葉系細胞であるST-2, 未分化間葉系細胞であるC2C12細胞培養系において導入し, アルカリフォスファターゼ活性染色, リアルタイムRT-PCR法を用いて, Runx2, osterix, I型コラーゲン, オステオカルシン, アルカリフォスファターゼ, BSP, MEPE, MMP-13などのmRNAの発現量を測定した. ある種のライブラリーでは, これらの骨芽細胞の分化指標のmRNAの増加が見出された. これらの結果から, このライブラリー中のmiRNAが同定されることによって, 骨芽細胞分化に機能するmiRNA分子の明らかになると考えられた.
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