2009 Fiscal Year Annual Research Report
化学プローブのデザイン・合成による動物個体イメージング
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20675004
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 Osaka University, 工学研究科, 教授 (70292951)
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| Keywords | 蛋白質ラベル化法 / タグ蛋白質 / 発蛍光型プローブ / β-lactamase変異体 / 蛍光標識 |
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| Research Abstract |
蛋白質の細胞内での可視化は、蛋白質の機能を解明する強力な手法であり、現在大きな注目を集めている。一方、蛋白質を蛍光小分子化合物でラベル化・可視化する既存の手法は細胞洗浄プロセスが煩雑である点や、特異性が低いなどの問題点があるため、新しい蛋白質ラベル化法が必要とされている。これまでに、β-lactamase変異体をタグ蛋白質として、発蛍光型プローブCCDにより標的蛋白質を蛍光標識する手法を開発してきた。CCDはβ-ラクタム系抗生物質に蛍光物質(クマリン誘導体)とそのクエンチャーをつないだ構造を有しており、β-lactamase変異体と結合し、蛍光強度が上昇するように設計されている。本研究では、この手法を生細胞に応用し、細胞内の標的蛋白質の可視化を行った。まず、β-lactamase変異体とCCDの反応の特異性を調べるために、細胞溶解液中でラベル化反応を行った。その結果、夾雑蛋白質存在下においてβ-lactamase変異体のみと反応することが明らかとなり、その反応は極めて特異的であることが示された。次に、標的蛋白質を上皮成長因子受容体EGFRとし、タグ蛋白質であるβ-lactamseをEGFRの細胞外ドメインに融合した蛋白質の遺伝子を設計した。この遺伝子を培養細胞において発現させ、CCDを添加すると、遺伝子発現が観測される細胞のみから蛍光が観測された。以上の結果から、本手法を用いることにより、生きたままの細胞で目的とする蛋白質を蛍光により可視化できることが明らかとなった。このことから、本手法は、生物研究において、蛋白質を可視化するための有用なツールとなることが期待される。
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