システム生物学・構成的生物学に基づく弛張型発振回路の設計と構築

2009 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20700271
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 柚木 克之 Keio University, 理工学部, 助教 (70433745)
• Keywords: システム生物学 / 合成生物学 / イメージング / 人工遺伝子回路 / 反応速度論 / 振動子 / 非線形力学系 / 分子拡散

Research Abstract

昨年度は、プロモーターの反応速度論定数を測定する系の構築に必要となるイメージング技術、特に、蛍光タンパク質分子数を推定する新規手法の開発を行った。先行研究では分子数推定に細胞分裂を利用していたため、分裂頻度が低い細胞での適用が困難であったが、本手法では画像解析技術の活用により細胞分裂なしに分子数を推定することが可能となった。分子数推定には先に挙げた先行研究以外にも蛍光相関分光法(FCS)などで可能となっているが、FCSは共焦点顕微鏡など高価な実験備品を必要とする。これに対し本手法では、より安価な通常の蛍光顕微鏡で分子数推定が可能である。実証実験の結果、比較的妥当な推定値が得られており、これに基づいて特許を出願する予定である。
反応速度論定数測定に必要なDNAコンストラクト構築は、昨年度中にほぼ完了している。転写制御因子を発現させるベクターとして、ナショナルバイオリソースプロジェクトより分譲して頂いたpBAD18-KanプラスミドのPBADプロモーター直下にlacI-mCherry、tetR-mCherry、cI-mCherryの3種の融合タンパク質遺伝子を挿入した。また、プロモーター側としてpCZ320プラスミドを一部改変したうえでPLlac01、PLtet01、PRそれぞれのプロモーター配列を挿入し、直下にgfpmut3b遺伝子を配置した。このうち、PLlac01以外の2種については構築を完了した。
転写調節因子発現用およびプロモーター用の2つのプラスミドDNAはそれぞれ大腸菌細胞に導入し、傾向タンパク質の発現を確認した。導入した大腸菌細胞中に発現した転写制御因子(赤色蛍光)と、その制御下にあるプロモーターから発現したGFPmut3bタンパク質(緑色蛍光)の分子数については、それぞれ前記の手法を用いて推定に成功した。