2008 Fiscal Year Annual Research Report
スプリットルシフェラーゼを用いた単一神経細胞でのCREB活性化計測
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20700331
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
石本 哲也 University of Toyama, 医学薬学研究部・分子神経科学講座, 助教 (40397170)
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| Keywords | ルシフェラーゼ / イメージング / CREB / リン酸化 |
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| Research Abstract |
20年度は、CREBの活性化を捉えるスプリットルシフェラーゼの改良を行った。今回の全体計画では1分子型のスプリットルシフェラーゼを神経細胞に発現させ、1細胞レベルでその発光の強度変化を計測することが目標となるので、発光強度のより強い分子を設計しなければならない。具体的に本年はCREBのリン酸化部位であるKIDドメインと、リン酸化したKIDドメインに結合するCBPのKIXドメインの間をつなぐリンカー部分の配列の改良を試みた。しかし年度初めに開発した1分子型のプローブ蛋白質に対して、大幅な発光の上昇は見られなかった。この結果はリンカー部分の改良に限界があることを示唆するものであった。今後、リンカー部分の改良以外の点に重点を置きながら、プローブ蛋白質の発光量をあげる試みを行っていきたい。発現ベクターのプロモーターの選択、蛍光蛋白質とプローブ蛋白質を組み合わせ、BRET効果によって発光量を増加させることができないか改良を続ける。また神経細胞への効果的な遺伝子導入法の選択も試みる。今年度はリポフェクション法を用いて実験を行ったが、レンチウイルスで神経細胞に遺伝子導入させることができないか試す。また20年度は、一分子型プローブに加えて、二分子型のCREBプローブの開発も始めた。これは1分子型に比べ現時点で発光量は大幅に劣るものの、S/N比の点で一分子型より優れていることから、引き続き二分子型プローブの改良も行う。
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Research Products
(2 results)
