小分子RNAを含むリボヌクレオプロテイン複合体の機能の構造基盤の解明

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20770079
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西増 弘志 The University of Tokyo, 医科学研究所, 助教 (00467044)
• Keywords: タンパク質 / 核酸 / 結晶構造

Research Abstract

ショウジョウバエの生殖細胞で発現するpiRNAは、Piwiサブファミリータンパク質と結合し、レトロトランスポゾンの発現抑制を介して、生殖細胞の新生と維持に関与する。piRNAの3'末端2'-OH基は新規のメチル化酵素Pimetによりメチル化されることが報告されているが、その機構はまったく不明である。そこで、PimetがpiRNAを認識して、メチル化する機構を明らかにすることを目指し、結晶構造解析を推進した。
ショウジョウバエ由来Pimetを、N末端にHis-tagを付加して大腸菌で大量発現させ、Ni-NTAカラム、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムを用いてSDS-PAGEで単一になるまで精製することに成功した。PimetはS-アデノシルメチオニン(SAM)をメチル基供与体として3-26塩基長piRNAの3'末端2'-oH基を配列非特異的にメチル化することが報告されている。そこで精製したPimetを用いて、(1)Pimet単独、(2)SAM存在下、(3)SAMと一本鎖RNA存在下で結晶化条件のスクリーニングをおこなった。しかし、全く結晶は得られなかった。そこで、保存性が低くディスオーダーしていると予想されるC末端部分を削った種々のコンストラクトを作製し、大腸菌で発現を検討し、C末端を〜40残基削った変異体が全長と同様に発現することを見出し、単一になるまで精製することに成功した。精製したPimet変異体を用いて、結晶化条件のスクリーニングを行っている。ショウジョウバエPimetに加えて、ヒト由来Pimet、マウス由来Pimet、およびディスオーダー領域が少ないと予想された昆虫Tribolium castaneum Pimetに関して、大腸菌での発現を検討した。しかし、ショウジョウバエPimetと異なり、どれも可溶性が低く精製途中で沈殿してしまうことがわかった