2010 Fiscal Year Annual Research Report

小分子RNAを含むリボヌクレオプロテイン複合体の機能の構造基盤の解明

Research Project

Project/Area Number	20770079
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	西増弘志東京大学, 大学院・理学系研究科, 特任助教 (00467044)
Keywords	タンパク質 / 核酸 / 結晶構造
Research Abstract	ショウジョウバエに由来するAGO1,AGO2,PIWI,AUB,AGO3,ヒトに由来するAGO1,回虫に由来するAGO,カビに由来するAGO,酵母に由来するAGO1を含む複数種類のArgonauteタンパク質のN末端にHisタグ,Strepタグ,TARGETタグなどのアフィニティータグを付加してSf9昆虫細胞やショウジョウバエS2細胞を用いて発現を試みた.その結果,Sf9昆虫細胞においていくつかのAgoタンパク質を可溶性画分に発現させることに成功した.N末端に付加するタグの種類によってAgoタンパク質の発現はおおきく変化することがわかった.今後はコンストラクション,発現条件(培養時間,培養温度感染させるバキュロウイルスのタイターなど)のさらなる検討を行うことによって結晶化実験に十分なAgoタンパク質を調製することを目指す. ショウジョウバエに由来するDicer1のN末端にHisタグを付加して大腸菌やSf9昆虫細胞を用いて発現を試みた.全長に加えて,ヘリカーゼドメイン,二本鎖RNA結合ドメイン,PAZドメイン,RNaseIIIドメインを含む複数種類の領域の発現を試みた。その結果,どの領域も大腸菌で発現させると不溶性画分に蓄積することがわかった.今後はさらにコンストラクションを作製するとともに,Sf9昆虫細胞での発現条件の検討を行い,結晶化実験に十分なDicerタンパク質を調製することを目指す.