2008 Fiscal Year Annual Research Report
「in v ivo光クロスリンク法」を用いた膜タンパク質間相互作用の網羅的解析
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20770148
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
樋野 展正 The Institute of Physical and Chemical Research, 拡張遺伝暗号システム研究チーム, 特別研究員 (90469916)
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| Keywords | タンパク質問相互作用 / クロスリンク / 非天然型アミノ酸 / 拡張遺伝暗号 / GPCR / RAMP / 質量分析 / プロテオミクス |
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| Research Abstract |
本研究は, Gタンパク質共役型受容体(GPCR)など創薬のターゲットとなる膜タンパク質を研究対象とし, それらが相互作用する膜タンパク質を「in vivo光クロスリンク法」を用いて網羅的に同定することで, 複合体としての機能を理解するための基盤となるデータを収集することを目的としている. 申請者らが開発した「in vivo光クロスリンク法」は, クロスリンカーとして働く「非天然型アミノ酸」を生細胞中で研究対象とするタンパク質に対して部位特畢的に導入し, 細胞に光を照射することによって相互作用しているタンパク質との間に架橋を形成させる方法である. さらに, 安定化した複合体を細胞より抽出・精製し, その構成成分を質量分析により同定することで, 細胞内で実際に生じていたタンパク質問相互作用を知ることができる. 本研究の研究対象としては, ある種のGPCRの機能を修飾する膜タンパク質であるRAMP1を選択した. この手法では, クロスリンカーをタンパク質間の相互作用表面に導入することが鍵となるが, RAMP1とGPCRの相互作用表面は明確にはわかっていない. そこで, RAMP1の細胞外ドメイン中の様々な箇所にクロスリンカーを導入した変異体を作製し, それぞれの変異体について既知の相互作用因子であるカルシトニン受容体様受容体(CRLR)と架橋が形成されるかどうかを調べた. その結果, 効率よく架橋が形成される数種類の変異体を得た. また, クロスリンカーの導入箇所と架橋の形成効率を照らし合わせることによって,両者の相互作用表面についての情報を得ることができた. さらに, 細胞内に発現しているCRLR以外の未知のタンパク質との間にも架橋が形成されることが示唆されたので, これら複合体を単離し, 構成成分を調べることによって, RAMP1が細胞内で相互作用している膜タンパク質群が明らかになると考えられる.
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