2008 Fiscal Year Annual Research Report
ショウジョウバエ培養細胞系を用いたリソソーム酵素局在化の分子機構の解析
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20770159
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
亀高 諭 Fukushima Medical University, 医学部, 講師 (10303950)
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| Keywords | クラスリン / ショウジョウバエ / ゴルジ体 / 試験管内再構成 / GGA |
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| Research Abstract |
平成20年度に於いては、Lerp, dGGA, dCHC(clathrin heavy chain)及びAP47(API complex mu-subunit)に対する特異性の高いペプチド抗体を作製し, さらにこれらの遺伝子の安定発現株をS2細胞で作製しその局在解析をはじめとする性状解析を行った。その結果, これらの分子群がショウジョウバエにおいても哺乳動物と同様にトランス側のゴルジ体膜上に局在することが明らかとなった。また、リコンビナント蛋白質を用いた結合実験、ドミナントネガティブ型変異体の作製、酵母ツーハイブリッドアッセイ及び、生化学的手法を用いた試験管内再構成系を用いて、dGGAがクラスリンと膜蛋白質性カーゴ分子との両方に結合しこれらの分子のゴルジ体膜上での会合を媒介することが示唆された。更に、RNAi法を用いた遺伝子ノックダウン実験により、dGGAがLERPの細胞内輸送に関与していることが示唆された。以上の結果より、これらの因子が共同してゴルジ体膜上における膜蛋白質の選別輸送を行っていることが強く示唆された。一方、GFP-dGGAを用いた生細胞における分子イメージングによりdGGAが極めて速いスピードでゴルジ体膜と細胞質問をサイクルしており、この挙動がARFIGTPaseにより制御されていることが分かった。また、単離ヘモサイト(血球系細胞)におけるdGGAの局在解析によりdGGAが生体内では限られた膜蛋白質のアダプターとして機能していることが示唆された。
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