2008 Fiscal Year Annual Research Report
変異遺伝子特異的な新規RNA干渉法の実用化を目指したin vivo投与での検討
Project/Area Number |
20790610
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Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
Principal Investigator |
久保寺 隆行 Tokyo Medical and Dental University, 大学院・医歯学総合研究科, メディカルフェロー (40376801)
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Keywords | siRNA / 遺伝子治療 / トランスジェニックマウス / AIS / SOD1 / AAV |
Research Abstract |
(1) siRNA抵抗性野生型SOD1発現ベクターの作製 マウスSOD1の中でsiRNAの標的部位となる塩基配列を, そのコドンよりコードされるアミノ酸は変えないように, 変換できる塩基をすべて置換し, siRNA抵抗性マウス野生型SOD1発現ベクターを作製した。 (2) siRNAとsiRNA抵抗性野生型SOD1の共導入ベクターの構築 先に作製したsiRNA抵抗性マウス野生型SOD1ベクターの上流に, 抗SOD1 siRNA発現ベクターのsiRNA転写ユニットを挿入して, 1つのベクター上にそれぞれ独自のプロモーター下にある抗SOD1 siRNAとsiRNA抵抗性マウス野生型SOD1 cDNAをタンデムに配置させた発現カセットを作製した。 (3) siRNAとsiRNA抵抗性野生型SOD1の共導入アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの作製 共導入カセットを挿入したAAVベクタープラスミドをAAVヘルパープラスミド, アデノウイルスヘルパープラスミドと共に293細胞にトランスフェクションにより一括導入してsiRNA/siRNA抵抗性マウス野生型SODl共導入AAVベクターを作製した。作製したAAVベクターを培養細胞にトランスダクションし, siRNAによって抑制された内因性SOD1の発現がsiRNA抵抗性野生型SOD1により補われていることを定量的RT-PCR及びウエスタンブロッティングにより確認した。 AAVベクターが機能していることを確認できたので, 来年度はマウスへのin vivo投与を行う予定である。
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