椎間板変性メカニズムの解析

2008 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20791035
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 前野 耕一郎 Kobe University, 医学部・附属病院, 助教 (70403269)
• Keywords: 椎間板変性 / ヒト椎間板不死化細胞株 / Fas / FasL / RNA干渉 / 過剰発現

Research Abstract

ヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株においてFasLの発現抑制、過剰発現を行った。
まず東海大学整形外科教室から譲渡して頂いたヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株を用いてsiRNAを用いたFasLの発現抑制を試みた。この細胞株におけるFasおよびFasLの発現は確認済みである。またFasLに対するsiRNAタンパクは、手術材料におけるヒト椎間板髄核細胞でその有効性を確認したものを使用した。しかしながらその発現抑制効果はRNAレベル、タンパクレベルともに数%〜数10%と大きなばらつきがみられた。何度も繰り返し実験を行い、その結果に対して厳密な統計処理を行ったにも関わらず、残念ながらこのヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株においてはsiRNAによるFasL発現抑制に有意な効果が得られなかった。この理由としては、この細胞株においてはFasLの発現は見られるものの、発現量そのものが絶対的に少ないためではないかと考えられた。以上の結果から、ヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株に内在性に発現しているFas、FasLをターゲットとしたRNA干渉による遺伝子抑制は断念した。そこで次にこのヒト椎間板髄核細胞の不死化細胞株にelectroporation法を用いたFasLの過剰発現を試みた。数回の再現性確認実験を行ったが当この方法によるFasLの発現率は実に常時60%以上と、極めて高い導入効率を示した。今後はこのFasL過剰発現細胞をマクロファージと共培養することで刺激し、そのcell lysatesからカスパーゼ8を中心としたdeath signal周辺遺伝子の発現量を定量する予定である。