2008 Fiscal Year Annual Research Report
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20890235
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
飯島 洋 Nihon University, 薬学部, 教授 (30465281)
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| Keywords | 酵素 / 活性化 / カテコール |
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| Research Abstract |
組換えCOMTの取得:ヒトのCOMT cDNAが含まれるプラスミドで形質転換された大腸菌(FL1002clone id=3503220, Invitrogen社)を購入し、プラスミドDNAを常法により精製した。このDNAから、合成した順方向プライマーならび逆方向プライマーを使用したPCRにより、COMT遺伝子を含む断片を増幅した。アガロース電気泳動により精製した断片を、BamH1, EcoR1で消化し、Gluthathion S-transferase (GST)融合タンパク質として発現させるために、pGEX-2Tプラスミド(GE Healthcare社)に組み込み、発現ベクターpGEX/COMTを得た。DNAの組み込みは核酸配列分析により確認した。
この大腸菌を通常のLB培地で培養し、波長600nmに対する濁度が0.4に達した時点でIPTGを添加して、GST融合タンパク質としてCOMTを発現させた。Gluthathioneアフィニティカラムで精製し、SDS電気泳動では高度に精製されていることを確認した。
活性測定系:高速液体クロマトグラフィーの立ち上げを実施した。イオン交換によるカテコールアミンの濃縮、濃縮したアミンのカウンターイオン法による逆相クロマト分離、カテコールのインライン反応による蛍光誘導体化に成功した。0-メチル化体の電気化学酸化による脱メチル化に取り組んでいる。
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