2008 Fiscal Year Annual Research Report
神経管形態形成運動に関与するグアニン交換因子のマウスモデルを用いた遺伝学的解析
| Project/Area Number |
20890292
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
|---|
Principal Investigator |
種子島 幸祐 Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (20507678)
|
|---|
| Keywords | WGEF / 神経管閉鎖障害 / 発生・分化 / 脳・神経 / シグナル伝達 / ノックアウトマウス / ES細胞 / 相同組み替え |
|---|
| Research Abstract |
本年度はWGEF遺伝子の相同組み替え用ターゲティングベクターの作成を行った。ターゲティングベクターはWGEFの遺伝子配列をもとに、Exon2の下流に選択マーカーとしてLoxPサイトをもつneoカセットを導入し、上流側にLoxPサイトを組み込むことによってCreによるWGEFのコンディショナルな遺伝子破壊を起こさせるようデザインした。ターゲティングベクターの作成は、BACの修飾法を用いて行った。薬剤選択のカセットを含む、BAC修飾用のベクターにWGEFの配列を組み込み、修飾用ベクターの配列とBACの配列で組み換えを起こすことによって、BAC cloneに目的のLoxPサイトと、neoカセットを組み込んだ。最終的にDTAを含むES細胞導入用のベクターに目的の断片を挿入し、WGEFコンディショナルノックアウトマウスのターゲティングベクターを作出することに成功した。また、ES細胞の相同組み替え体のスクリーニング条件を検討するため、スクリーニングに使うPCR領域を含む断片をクローニングしたコントロールベクターを作製し、ES細胞に導入して、実際にスクリーニングに用いるプライマーでPCRを行った。その結果、スクリーニングに最適なprimerペアとPCR条件が決定できた。この条件をもとに、ターゲティングベクターをES細胞に導入して、neomycin耐性クローンを選択し、相同組み替えESクローンのスクリーニングを行った。PCR法により、全400クローンをスクリーニングしたが、組み替えクローンを得ることはできなかった。今年度はクローン数をスケールアップすることにより、組み替えESクローンを取得した後ノックアウトマウスを作出し、交配によってノックアウトマウスを得る。
|
