2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the molecular mechanism of transdifferentiation of chondrocytes into osteoblasts and the origin of bone marrow osteoblasts
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20F20407
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
QIN XIN 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2020-11-13 – 2023-03-31
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| Keywords | Runx2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Runx2は、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化に必須な転写因子であるが、骨芽細胞分化後の機能は、解明されていなかった。この解明には、骨芽細胞分化後にRunx2を欠失させる必要がある。この目的のために2.3 kb Col1a1プロモーターによって駆動されるCre(Col1a1 Cre)マウスが用いられる。しかし、現在世界中で使用されているCol1a1 Creマウスは欠失効率が悪く、明確な表現型が得られないことが多い。既に発表されているCol1a1 Cre を用いたRunx2欠失マウスも表現型が認められていない。我々は、GFP-Cre融合タンパク質によりCreの発現パターンも確認できるCol1a1 GFP-Creマウスを独自に作製し、Runx2を骨芽細胞分化後に完全に機能消失させた。骨量は、マイクロCT解析で、オスメスともに海面骨骨量、皮質骨厚は減少し、骨組織形態計測では、骨芽細胞のパラメーターが減少し、骨形成は低下していた。さらに、骨芽細胞の増殖低下も観察された。また、Rankl発現およびRankl/Opg比は低下し、骨吸収の低下が見られた。野生型マウスの骨芽細胞は、細胞質が豊富で柱状構造を示したが、Runx2欠失マウスでは、細胞質が少なく、扁平化していた。主要骨基質タンパク質であるCol1a1, Col1a2, Spp1, Ibsp, Bgalap/Bglap2発現は低下し、Runx2がこれらの遺伝子発現に必要であることが明らかとなった。すなわち、骨芽細胞の主要機能である骨基質タンパク質遺伝子発現に、Runx2が主要な役割を果たしていることを解明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
骨芽細胞分化後のRunx2の機能を解析するために、骨芽細胞分化後に発現するCol1a1 Creマウスを用いたコンディショナルノックアウトマウスが２グループから報告された。１グループは、DNA結合ドメインを欠失させ、完全にRunx2の機能を欠損させたが、表現型は認められなかった。もう一方のグループでは、８番目エクソンを欠失させ、Runx2のDNA結合能を保持するが機能が低下したRunx2タンパク質が形成された。マイクロCT解析結果のみ報告されたが、骨量が減少していた。同一由来のCreマウスを用いながら、機能を完全に欠損させたマウスでは表現型がなく、機能が一部保持されたマウスで表現型が認められるという奇異な結果となった。前者では、Col1a1 Creによる欠失効率が十分でないこと、後者では、DNA結合能を持った異常なRunx2タンパク質が、骨芽細胞増殖を促進する同ファミリー分子Runx3のDNA結合を阻害した可能性が考えられた。したがって、Runx2の骨芽細胞分化後の機能は、解明すべき課題として残った。課題解決には、DNA結合ドメインを欠失させ完全にRunx2の機能を欠損させること、かつ欠失効率の良いCol1a1 Creマウスを用いることが必要であった。そこで、我々は、GFP-Cre融合タンパクを発現させ、骨芽細胞特異的発現も確認できるようにした独自のCol1a1 Creマウスを作製した。このマウスとRunx2 floxマウスを交配し、Runx2を骨芽細胞分化後に欠失させた。マイクロCT、骨組織形態計測、免疫組織染色、遺伝子発現、血清マーカー等により野生型マウスと比較し、Runx2が骨芽細胞分化後に、主要な骨基質タンパク質遺伝子発現を制御し、骨形成を促進させることを明らかにした。また、骨芽細胞の増殖も促進させること、Ranklを誘導し骨吸収を促進させることも明らかにした。したがって、骨芽細胞分化後の骨基質タンパク質遺伝子発現制御機能の解明は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）終末期肥大軟骨細胞層周囲のbone collarの骨芽細胞から産生される因子が終末期肥大軟骨細胞から骨芽細胞への分化転換を誘導していると推察されるため、胎生14.5日(E14.5)及びE15.5の1.3 kb Runx2 enhancer Tomato (En-Tomato)マウスの大腿骨からTomato陽性細胞をFACSでソーティングし、mRNAシークエンスを行い、bone collarの骨芽細胞で発現している分化、増殖因子を選定する。
２）頭蓋の泉門、縫合での未分化間葉型細胞から骨芽細胞系列への分化には、hedgehog、Wnt、FGF、Pthlh、BMP、TGFβが関与していた。これらの因子のコンビネーションおよび上記の因子とのコンビネーションで、E15.5のEn-Tomatoマウスの初期軟骨細胞培養を行い、分化転換が起こるか検討を続ける。
３）Col10 Cre tg(Cre)マウス、Runx2 floxマウス、mTFP1 (monomeric teal fluorescent protein)をRosa26遺伝子座にノックインしたR26-CAG-LoxP-mTFP1(R26)マウスを交配してR26Creマウスおよび分化転換の起こらないRunx2fl/flCreR26マウスを作製した。これらのマウスの分化転換が起きる直前のE15.5と分化転換が起き始めたE16.5の大腿骨よりmTFP1陽性細胞をFACSで分離し、R26CreマウスとRunx2fl/flCreR26マウス間、およびR26CreマウスのE15.5とE16.5間でマイクロアレイ解析を行い、分化・増殖因子を選定する。
４）上記１－３の分化、増殖因子の様々なコンビネーションで、E15.5のEn-Tomatoマウスの初期軟骨細胞培養を行い、最終的に軟骨細胞から骨芽細胞への分化転換に必要なシグナル経路を特定する。
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