2021 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of a Structural and/or Functional Model of New Light-harvesting System Using Artificial Hemoprotein Assembly
| Project/Area Number |
20H00403
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
林 高史 大阪大学, 工学研究科, 教授 (20222226)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小野田 晃 北海道大学, 地球環境科学研究院, 教授 (60366424)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | ヘムタンパク質 / 光捕集系 / GFP / エネルギー移動 / 人工光合成 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年、植物の光合成に関する作用機序が次々と明らかとなり、光合成の活性中心を模倣・応用する研究も盛んに実施されている。そのモデル研究の多くは低分子の色素を合成化学的・超分子化学的に集積させるアプローチである。本研究では、光合成初期過程の光捕集アンテナ組織に学び、これまで我々が精力的に実施しているヘムタンパク質人工集積化手法を駆使して、多数の色素をタンパク質マトリクス内に環状に配置した人工光捕集系の構築を行うための基盤作りを実施している。これまでに、HTHP (Hexameric tyrosine-coordinated heme protein)と呼ばれているヘムタンパク質6量体（天然の機能は不明）を核として、六量体の一つ一つのヘムポケットにチトクロムb562（電子移動ヘムタンパク質）のオリゴマーを放射状に伸ばすStar-shaped 集合体の形成を行った。しかし、予想していたようにHTHPを核としてチトクロムb562のオリゴマーが成長することがなく、大きな集合体が得られなかった。そこで、チトクロムb562同士を、2,2’-ジピリジルジスルフィドを用いて、ジスルフィド結合で結ぶ集合体の形成方法の確立と、その手法を用いてチトクロムb562と新たなタンパク質としてgreen fluorescent protein (GFP)を共有結合で結び、光励起エネルギー移動を観測した。その結果、チトクロムb562の異種変異体間の選択的な2量体、3量体合成を獲得すると共に、同手法を用いて、GFPとチトクロムb562の複合体内でのエネルギー移動を蛍光分光測定と蛍光寿命から測定し、両タンパク質間の結合位置にGFPの蛍光寿命が依存することが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、まず安定なタンパク質複合体の構造を得るために、表面にシステイン残基を有する電子伝達ヘムタンパク質であるチトクロムb562変異体を幾つか調製した。例えばタンパク質表面の80番目のアスパラギンをシステインに置換したN80C変異体を調製した。同様に、E49CやE49C/N80C二重変異体なども調製した。次に2,2’-ジピリジルジスルフィドを用いて、タンパク質表面のシステインを活性化し、その状態で別のシステインを有するチトクロムb562変異体を添加し、目的の2量体を得た。この結果、E80C-E49Cのヘテロ二量体が収率良く得られた。また、二重変異体を用いると、N80C-E49/N80C-N80Cなどの3量体も選択的に得られた。このように目的に応じたタンパク質複合体を得る手法を開発した。さらにこの方法を利用して、チトクロムb562のN80Cを活性化して、GFPのK26C変異体を混合することにより、速やかにGFP-チトクロムb562複合体が得られた。この複合体の同定を行ったのちに、蛍光分光測定からGFPの蛍光が約87%消光し、蛍光寿命から、GFPからチトクロムb562への光駆動型エネルギー移動の速度を見積もった。さらに、チトクロムb562の他の変異体とGFPとの二量体も幾つか調製し、それぞれの結合位置の違いによるエネルギー移動の相違を確認した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
次は、チトクロムb562やGFPの様々な変異体等のタンパク質にも新たに着手し、新しい人工光捕集系の創製の基盤を築く。具体的には次の２項目を中心に研究を展開する。
まず、チトクロムb562およびGFPの表面に遺伝子工学的にそれぞれ新たなシステイン残基を導入する。そして、片方のシステイン残基末端のチオール基を活性化させ、チトクロムb562とGFPの複合体（タンパク質ヘテロ２量体）を合成する。その際に変異導入するシステインについて、異なるいくつかの箇所を選択し、様々なヘテロ２量体を獲得する。次に光励起を行うことにより、GFPからチトクロムb562へのエネルギー移動の観測を実施する。特に、蛍光寿命を測定し、その速度の評価を行い、人工光補修系に必要なヘテロ２量体の適した立体構造を探る。
次に、アンテナとして必要な、チトクロムb562同士の巨大な集合体の構築を試みる。こちらも、チトクロムb562の表面にシステイン残基を導入し、ジスルフィド結合を介した複合体調製に挑戦する。やはりチトクロムb562の表面に導入するシステイン残基の位置をいくつか変化させ、効率的な２量体形成を行う。さらにチトクロムb562の２つの位置にそれぞれシステイン残基を導入する変異体も調製し、これまでは、おもにタンパク質2量体を試みたが、今後は３量体、４量体等々を得る。これらのチトクロムb562はヘム（鉄ポルフィリン）を有するが、このヘムを亜鉛ポルフィリンに置換することにより、得られたタンパク質オリゴマーの光励起エネルギー反応の評価を実施する。
|
