2021 Fiscal Year Annual Research Report
クロマチン上で起こる転写と共役した二重鎖切断修復の分子機構の解明
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20H00449
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
胡桃坂 仁志 東京大学, 定量生命科学研究所, 教授 (80300870)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
香川 亘 明星大学, 理工学部, 教授 (70415123)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム / 遺伝子 / 癌 / 蛋白質 / 放射線 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物では、ゲノムDNAはクロマチンを形成することで細胞核内に収納されている。クロマチンは、DNAを損傷から保護する役割を担っていると考えられているが、一方で、DNA損傷修復に対して阻害的にも働く。細胞には、ゲノムDNA二重鎖切断損傷を正確に修復するための機構が備わっている。増殖時の細胞では、複製された染色体を鋳型にした相同組換え修復（HRR）によって二重鎖切断修復を行うことが可能となる。他方、非分裂細胞では、鋳型となるべき複製された染色体が存在しないため、転写と共役した二重鎖切断修復（TC-HR）が提案されている。本研究では、TC-HRで機能すると考えられるRAD52やRAD51を中心に、これらがCSBなどのクロマチンリモデリング因子と協同的に、クロマチン上でDNA損傷修復を行うしくみを解明することを目指す。本目的を達成するために、以下の計画１－３の研究を行なった。＜計画１＞ CSBが二重鎖切断損傷と遭遇したRNAポリメラーゼを認識するしくみの解明：損傷依存的にヌクレオソーム中で停止したRNAポリメラーゼとヌクレオソームとの複合体の調製に成功した。並行して、昨年度に精製系を確立したCSBのPichia属の酵母ホモログであるRAD26を用いて、RAD26とヌクレオソームとの複合体の形成を生化学的に検討した。＜計画２＞ クロマチン構造の基本単位であるヌクレオソームの構造を変換するしくみ： CSBによるクロマチンリモデリングの分子機構を明らかにするために、RAD26とヌクレオソームとの複合体のクライオ電子顕微鏡による解析を開始し、データの取得に成功した。＜計画３＞ RNAに依存したDNA修復反応におけるRAD52の役割：本年度は、全長のRAD52の立体構造解析をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析によって行い、RAD52が多様な多量体を形成することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、計画している３項目全てにおいて、当初の計画以上の進展が見られた。＜計画１＞ 「CSBが二重鎖切断損傷と遭遇したRNAポリメラーゼを認識するしくみの解明」では、DNA損傷に依存してRNAポリメラーゼがヌクレオソーム中で停止する系を、これまでに確立済みであったPichia属の酵母のRNAポリメラーゼIIを用いた試験管内転写系を発展させることによって構築することに成功した。本実験系の確立は、Pichia RAD26のクロマチンにおける損傷認識と修復反応における機能を明らかにするために重要なツールを提供し、当初の計画を上回る成果を得ている。＜計画２＞ 「クロマチン構造の基本単位であるヌクレオソームの構造を変換するしくみ」では、ヌクレオソームリモデリング反応の中間体構造を可視化するために、Pichia酵母由来のヒストンを用いたヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡解析を行なった。現在、Pichia酵母ヌクレオソームのクライオ電子顕微鏡データの取得に成功しており、立体構造解析を行なっている。また昨年度に引き続き、リンカーDNAを含むヌクレオソームの再構成およびクライオ電子顕微鏡での構造解析を、CSB、RAD52、RAD51などとの複合体を含めて行なっている。＜計画３＞「RNAに依存したDNA修復反応におけるRAD52の役割」では、全長のRAD52の立体構造解析をクライオ電子顕微鏡によって行なっている。その結果、RAD52が多様な多量体を形成するということが明らかになり、それらの構造解析を遂行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画している３項目において、順調に進展しているため、計画通りに研究を推進する。＜計画１＞ 「CSBが二重鎖切断損傷と遭遇したRNAポリメラーゼを認識するしくみの解明」では、本年度確立した、DNA損傷に依存してRNAポリメラーゼがヌクレオソーム中で停止する系を用いて転写実験を行い、並行してクライオ電子顕微鏡での立体構造解析を行うことで、RNAポリメラーゼIIによるヌクレオソーム中でのDNA損傷認識および修復の分子機構を明らかにする。＜計画２＞ 「クロマチン構造の基本単位であるヌクレオソームの構造を変換するしくみ」では、試験管内でのクロマチン転写系とクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を併用することで、CSB、RAD52、RAD51、ヌクレオソームなどによって作り出されるクロマチンリモデリングの中間体構造と反応機構の解明を目指す。それによって、これらのDNA修復因子が、クロマチンにおけるDNA損傷に対してどのように機能するのかを明らかにする。＜計画３＞「RNAに依存したDNA修復反応におけるRAD52の役割」では、本年度明らかにした全長RAD52の高次構造多様性の機能的意義の解明を、生化学およびクライオ電子顕微鏡解析を併用することで推進する。
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