2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural physiology of channels based on development of cryo-electron microscopy
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20H00451
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
藤吉 好則 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特別栄誉教授 (80142298)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
沼本 修孝 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (20378582)
亀川 亜希子 東京医科歯科大学, 高等研究院, プロジェクト助教 (50867554)
谷村 幸宏 東京医科歯科大学, 高等研究院, プロジェクト助教 (80546515)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | クライオ電子顕微鏡法 / 単粒子解析法 / 構造生理学 / 膜タンパク質 / 水チャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの体の恒常性を保つ水を中心とする生理機能について、関連する分子の立体構造から詳細に理解することを本研究の目的としている。これまでに実績を積んできた、膜タンパク質の発現と精製法を活用すると共に、クライオ電子顕微鏡を中心とする研究実績に基づいて研究を進めた。
1) TJの構造と機能を、Cldnsの立体構造解析に基づいて理解するために、Cldn--18stの構造解析を目指して発現と精製に成功した。 2) TJの立体構造を解析することによって、パラセルラーチャネルのイオン選択制やバリア機能の理解を目指すために、染色法を用いて、TJのトモグラフィー解析を行ってTJの立体構造を得た。 3) ウェルシュ菌毒素のC末端側（C-CPE）とCldn-3との複合体の構造解析を基に、TJを制御するためにC-CPEへの変異を設計するとともに、アッセイ系を構築した。 4) 腎臓集合管に発現しているV2RとGs（3量体）との複合体の単粒子解析を目指して、この複合体の発現と精製に成功した。 5) hAC6とGs複合体の構造解析を目指すが、より発現状況が良い、hAC9とGsとの複合体の構造解析を目指し、hAC9の発現・精製に成功した。 6) hAC6の発現と精製が可能なコンストラクトを作製し、発現にも成功した。 7) AQP2の単粒子解析法による構造解析を行うために、AQP2の大量発現と精製を進めた結果、AQP2の発現・精製に成功した。
以上のように、所期の目的である、水チャネルを制御した恒常性維持機構を高分解能の構造解析に基づいて理解するという研究課題の達成を目指して、上記のように研究を進めた。なお、V2R-Gs複合体の構造解析が２つのグループにより解析されたので、これに従った計画変更が必要となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、ヒトの体の恒常性を保つ水を中心とする生理機能を関連する分子の立体構造から詳細に理解することを目指して、2020年度は研究課題のそれぞれについて研究を進めた。具体的には、以下の7つの研究課題のすべてについて研究を進めることで、おおむね計画通りの成果を得た。
1) TJの構造と機能を、Cldnsの立体構造解析に基づいて理解するために、Cldn--18stの構造解析を目指してこのCldn--18stの発現と精製を行い、構造解析用の精製に成功した。2) 染色法を用いて、TJのトモグラフィー解析研究を進めた結果、TJのトモグラフィー解析に成功した。3) Cldn-3とウェルシュ菌毒素のC末端側ドメイン（CCPE）との複合体の構造解析を基に、TJの制御を目指したCCPEの設計を行った。4) バソプレッシン受容体、V2RとGs（3量体）との複合体の構造解析を目指して、この複合体の発現と精製に成功した。ただし、最近、2つのグループにより、V2RとGsとの複合体の構造が解析された。それゆえ、今後はこれらの構造を活用した計画とする必要がある。5) AQP2カスケードに重要なhAC6と類似のhAC9とGsとの複合体の構造解析をまず目指すこととして、hAC9の発現・精製を行い、これに成功した。6) hAC9の発現と並行してhAC6の発現と精製のためのコンストラクトを作製し、発現・精製を行った。7) AQP2の構造解析が単粒子解析法を用いて行えるかを検討するために、AQP2の大量発現と精製を行った。
以上のように、所期の目的である、水チャネルを制御した恒常性維持機構を高分解能の構造解析に基づいて理解するという研究課題の達成を目指して、上記のように総合的に研究を進めており、V2R-Gs複合体の構造が他の2グループにより解析されるという状況変化が生じたが、基本的に順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトの体の恒常性を保つ水を中心とする生理機能を関連するそれぞれの分子の立体構造に基づいて詳細に理解することが本研究の目的である。7つの研究課題のうち、バソプレッシン受容体の構造解析が他のグループによりなされた状況変化に対応すると共に、それぞれの研究を加速して推進する必要がある。
1) TJの構造と機能を、Cldnsの立体構造解析に基づいて理解するために、大量発現と精製に成功したCldn--18stをはじめ他のCldnsの発現と精製を進めるとともに、結晶化を試みる。 2) 染色法を用いたTJのトモグラフィー解析を進めると共に、クライオ電子顕微鏡を用いて、非染色の条件でのTJのトモグラフィー解析を試みる。 3) ウェルシュ菌毒素のC末端側ドメイン（CCPE）などの改変の設計を行うと共に、TJの制御を目指したペプチドの開発を進める。 4) バソプレッシン受容体、V2RとGs（3量体）の構造が、最近2つのグループにより解析された状況を受けて、これらの構造を基に、VR2から、hAC6へのシグナル伝達機構の解明を目指す。 5) hAC9の発現と精製に成功しているので、hAC9とGsとの複合体のクライオ電子顕微鏡像を撮影して、構造解析を目指す。 6) hAC9の発現と並行して、hAC6の発現と精製を行い、Gsとの複合体の構造安定性などの確認を行い、クライオ電子顕微鏡でのデータ収集を目指す。 7) AQP2の大量発現と精製に成功したので、ナノディスクに入れる条件検討を進め、クライオ電子顕微鏡でのデータ収集が可能な条件を検討する。
以上のように、水チャネルを制御した恒常性維持機構を高分解能の構造解析に基づいて理解するという研究課題の達成を目指して、しかも、V2R-Gs複合体の構造が他の2グループにより解析された状況に対応して、より迅速、かつ総合的に研究を進める。
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