2022 Fiscal Year Annual Research Report
Structural elucidation of Wnt signaling mechanism using unique chemical tools
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20H00455
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高木 淳一 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90212000)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Wntシグナル / ケミカルバイオロジー / 立体構造解析 / 環状ペプチド / アンタゴニスト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、様々な組織幹細胞の分化状態を制御する鍵因子であるWntシグナルパスウェイについて、ケミカルバイオロジーツールの作用メカニズムの解明を通してその分子論の理解を深めるとともに、環状ペプチドをプローブとしてWntシグナル伝達系の機能構造研究に応用することを目指し、以下の２つの業務項目（②と⑥）に従って研究を進めた。なお、プロジェクト開始時の業務項目①、③、④についてはR3年度開始時までに終了もしくは中止し、R3から着手した⑤についてはR4年度の計画書に記載したように⑥へと内容を変更したので記載しない。
（項目②）LRP6：USAG-1相互作用の構造基盤とWntシグナル阻害メカニズム：内因性のWnt阻害物質であるUSAG-1について、当初目指していたLRP6-USAG1複合体結晶化の代わりに京都大学の高橋克博士と共同で作製した抗USAG-1中和抗体をもちい、抗体-USAG-1複合体の構造解析を目指した。5種類の抗体の遺伝子配列を元に発現コンストラクトを作製し、すべてについて動物細胞発現系で組換え抗体を入手することに成功した。このうち抗体E37については結晶化に適した小型抗体フォーマットFv-claspの形に変換して結晶化を行い、年度末までに微結晶を得た。これらに平行して、抗原であるUSAG-1タンパク質も結晶化に最適な発現コンストラクトの作製とそれを用いた精製条件の確率まで終了した。
（項目⑥）構造情報を利用したWntタンパク質安定化と精製法の確立：自ら決定したWnt3の構造と、その後他のグループから発表されたWnt3aの構造の間で見られたN末端領域の違いをヒントに、疎水性残基を溶液から隠すような変異体をデザインし、その安定化能を評価した。デザインした変異体は組み換え発現効率と精製効率において予想通り優れていたが、残念ながら生理活性を喪失していたので、目的は達成できなかった。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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