2020 Fiscal Year Annual Research Report
組織学と複合した単一細胞DNAメチル化解析法による原始卵胞淘汰過程の解明
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20H00471
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 配偶子形成 / 生殖細胞 / シングルセル / 単一細胞 / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は切片からレーザーマイクロダイセクションで採取した細胞を想定した、微量ゲノムDNAをBisulfite処理して、Post bisulfite adaptor tagging (PBAT) ライブラリを調製する手法を検討した。既存のPBAT法（tPBAT）ではシングルセルレベルに適用するにはアダプターDNAが過剰である可能性のあることが示唆された。また切り出しに適した切片の詳細な形態観察を向上させるため、シムをスライドガラスとカバーガラスの間に挟みこんで、揮発性マウント剤を使用して鮮明な顕微鏡画像を得る手法を考案した。DNAメチロームデータの解析を行うための準備として、データ解析サーバーを導入し、セットアップを行った。切片からのcDNA増幅については、当初、まったく想定していなかった問題が発生した。本研究で使用してきたRNase inhibitorの一つが年度の途中で突如販売中止になった。代替のRNase inhibitorの選定と条件検討には難航したが、試行錯誤の結果、他のRNase inhibitorの添加量を工夫するなどして、これまでと同程度のRNaseの阻害活性を発揮する、RNase inhibitorとそれらの添加条件の組み合わせを同定することができた。またホルマリン固定されたサンプルに対してトランスクリプトーム解析やDNAメチローム解析が適用できれば、切片からの解析における利便性が各段に向上する。このため細胞をホルマリン固定して効率よくcDNA増幅ができるかを検討した。単一細胞レベルでの増幅はまだできていないが10細胞程度であれば通常の免疫染色に適用可能なきちんとした固定条件から過固定条件までの広い固定条件領域で生の細胞に近い効率での増幅ができることがわかりDNAメチル化解析との複合が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、本研究で採用していた、研究代表者が長年使用してきた高品質なRNase inhibitorの製造中止が9月に判明し、代替品の検討が難航したが、最終的には適切な代替製品と条件を発見することができた。一方で、当初の予定を越えてホルマリン固定したサンプルからも効率のよいcDNA増幅ができることが判明し、固定組織からの全長RNA解析やDNAメチル化との複合が期待される結果を得た。これらの理由から、予定通りに進行している、と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今度に引き続き、微量DNAライブラリの作出手法を改善し、切片から回収された「シングルセルに適用可能なライブラリ作出条件を検討する。同時にホルマリン固定した細胞からのcDNA増幅手法を改善しシングルセルレベルで生細胞に比較可能な効率で遺伝子発現解析可能な手法にできるか検討する。
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