2021 Fiscal Year Annual Research Report
組織学と複合した単一細胞DNAメチル化解析法による原始卵胞淘汰過程の解明
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20H00471
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 配偶子形成 / 生殖細胞 / シングルセル / DNAメチローム / トランスクリプトーム / 組織切片 / 形態 / メチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は前年度に引き続き、切片から、PBATと複合可能なトランスクリプトーム解析法の開発を行い、昨年度までの問題を解決して完成させた。現在、論文投稿後査読対応を行っている。また、DNAメチル化解析と複合させるために、単一細胞レベルにまで希釈したゲノムDNAについてtPBATを適用するための条件検討を行っている。既報のようにtPBATは20細胞程度までの少量のDNAに対して非常に精度の高い解析が可能である。一方、単一細胞に適用可能な手法は複数報告されているが、いずれもtPBATには比較し得ない精度である。したがってtPBATを単一細胞に適用可能にすることが、組織中の単一細胞の遺伝子発現解析と、DNAメチル化解析を高い水準で複合させるために必要である。Bisulfite処理したDNAのライブラリ化を定量するために、主要な繰り返し配列であるLINE 1に対するプライマー（C→T converted） をデザインして、リアルタイムＰＣＲによる定量に用いた。その結果1000コピーから段階的に希釈していったゲノムDNAは、1細胞レベルまで正確に定量的にライブラリ化されていることが確かめられた（DNA重量に対するライブラリ化DNA量の回帰直線の傾きは1.05、相関係数は0.98であった）。しかしながら、一方で、ライブラリに含まれるDNA量（ゲノムDNAを含まずに形成されるアダプターダイマーを含む）が大過剰であり、少量のDNAに対して反応しなかったアダプター同士がダイマーを形成して、形成されるライブラリDNAの大半を占めていることが示された。この原因を検討し、アダプターダイマーが大過剰とならない条件を検討した。現在再現性を含めて詳細に解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、単一細胞レベルのDNAに対するライブラリ作出法の開発にとりくみ、昨年度末に示唆されていた問題を確認した。その解決法を見出しつつあるため、おおむね順調に進行している、と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続き、微量DNAライブラリの作出手法を改善し、切片から回収された「シングルセルに適用可能なライブラリ作出条件を検討する。適切な条件が得られたら、新鮮な状態で採取した1細胞および、切片から採取・溶解（すでに発現解析法のために確率済みの切片作出条件を用いる）した細胞からのPBATライブラリの作成を検討する。
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