A study of pathogenic B-cell memory function and its regulation using an autoimmune IgA nephropathy mouse model

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H00510
• Research Institution: Tokyo University of Science
• Principal Investigator: 北村 大介 東京理科大学, 研究推進機構生命医科学研究所, 教授 (70204914)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 自己免疫疾患 / 自己抗体 / 記憶B細胞 / IgA腎症 / 交差反応

Outline of Annual Research Achievements

近年、記憶B細胞の断続的な活性化が長期抗体産生に関わっていること、また、記憶B細胞の抗原提示・エフェクター機能が自己免疫疾患の病因として注目されている。本研究は、自己免疫疾患の病態における記憶B細胞の役割や作用機序、制御機構を明らかにし、病原性記憶B細胞を標的とした免疫制御方法を見出すことを目的としている。
本研究では、原発性糸球体腎炎の中で罹患率が最も高いIgA腎症のモデルであるgddYマウスを用いている。gddYマウスは8週齢までにほぼ全個体が尿蛋白陽性となり、糸球体メサンギウムへのIgA免疫複合体の沈着、メサンギウム細胞の増殖という糸球体病変が進行する。われわれはgddYマウスの血清IgAが腎糸球体に結合し、メサンギウム細胞中のタンパクに結合することを見出し、その１つとしてβII-spectrin を同定した。IgA腎症患者血清中のIgAも高頻度でβII-spectrin に結合した。また、gddYマウスの腎臓にIgA型の形質芽細胞が加齢とともに蓄積し、この細胞が産生するIgAはβII-spectrin を含むメサンギウムタンパクに結合した。以上より、IgA腎症がメサンギウムを標的とする自己免疫疾患であることを示した。
さらに、gddYマウスにおける腎への形質芽細胞の蓄積、尿タンパク、血清抗メサンギウムIgA抗体の産生が抗生剤により低減することから、この病態が常在細菌に依存することを見出した。また、gddYマウスの血清IgAや腎形質芽細胞が産生するIgAがgddYマウス特有の常在細菌に結合することもわかった。以上より、IgA腎症では特定の常在細菌に感作されたB細胞が体細胞突然変異を経て記憶B細胞となり、同じ菌に応答して継続的にIgA型形質芽細胞となり、交差反応によりメサンギウム蛋白に結合するIgA自己抗体を産生すると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

gddYマウスの腎に浸潤したIgA+形質細胞のシングルセルからIgH/L鎖V領域遺伝子を単離し、IgAリコンビナント抗体抗体（rIgA）を作製した。そのうち、メサンギウム細胞およびβII-spectrin に結合するrIgAを選択して以降の実験に使用した。これらのrIgAは腎糸球体から単離したメサンギウム細胞の表面に結合したが、内皮細胞や足細胞には結合しなかった。また、HEK293細胞に遺伝子導入したβII-spectrinは細胞表面に発現し、上記rIgAがそれに結合することを見出した。さらに、内在性IgAを欠失するAicda-/-マウスにそのrIgAを経静脈投与すると、糸球体のメサンギウムに沈着した。以上より、細胞内タンパクであるβII-spectrinがメサンギウム細胞では細胞表面に発現し、IgA自己抗体がそれに結合してIgA腎症を惹起していると考えられた。
また、gddYマウスIgAが認識するもう１つのメサンギウム自己抗原を同定し、それを認識する腎IgA+形質細胞由来のリコンビナント抗体（#66）を選択した。この抗体もメサンギウム細胞表面に発現するタンパクを認識し、さらに、口腔内常在細菌に交差反応性を示した。#66が結合した細菌を単離し16S rRNAシークエンス法で解析したところ、Streptococcus属であることが判明した。

Strategy for Future Research Activity

想定される自己反応性記憶B細胞の存在を検証するために、同定した自己抗原のテトラマーを作製し、gddYマウスの腎臓、脾臓、リンパ組織、末梢血のB細胞をフローサイトメトリーにより解析する。結合したIgA型またはIgG型B細胞の単細胞BCRレパトア解析を行う。この結果と、腎臓IgA+形質細胞のIgAレパトアと比較することによって、それらが記憶B細胞から分化したことを証明する。この共通するIgH/L鎖遺伝子からリコンビナント抗体を作製し、それらのメサンギウム細胞や同定した自己抗原、常在細菌への反応性を調べる。
gddYマウスにおいて常在細菌依存的に産生されるIgA抗体が自己抗原と交差反応していることを証明するために、リコンビナント抗体が認識するβII-spectrinや新規自己抗原の結合部位、さらに、細菌の部位を特定し、それらの構造を比較する。
また、in vivoで腎メサンギウムに結合したrIgA抗体の病原性を明らかにするために、このrIgAを正常マウスに投与後、糸球体病変を惹起するか組織学的に調べる。また、ガラクトース転移酵素欠損HEK293細胞を作製し、それに遺伝子導入することで、ガラクトース欠損型rIgAを作製し、これを同様にマウスに投与する。
さらに、細胞内蛋白であるβII-spectrin がメサンギウム特異的に細胞膜上に表出するメカニズムを解明するために、βII-spectrinを表出しないヒト細胞株を対照として、βII-spectrinを導入したHEK293細胞からβII-spectrinを免疫沈降し、結合したタンパクを質量分析により解析する。同定したタンパクについてβII-spectrinとの結合が確認されたものは、HEK293細胞においてCRISPR/Cas9法によりその遺伝子をノックアウトし、それによってβII-spectrinの細胞表面発現が阻害されるかを調べる。

Research Products

• [Journal Article] Integrin CD11b provides a new marker of pre-germinal center IgA+ B cells in murine Peyer's patches (2022)
  • Author(s): Gao P, Adachi T, Okai S, Morita N, Kitamura D, Shinkura R.
  • Journal Title: International Immunology Volume: 34 Pages: 249-262
  • DOI: 10.1093/intimm/dxab113
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An IL-9-pulmonary macrophage axis defines the allergic lung inflammatory environment. (2022)
  • Author(s): Fu, Y., Wang, J., Zhou, B., Pajulas, A., Gao, H., Ramdas, B., Koh, B., Ulrich, B.J., Yang, S., Kapur, R., Renauld, J.-C., Paczesny, S., Liu, Y., Tighe, R.M., Licona-Limon, P., Flavell, R.A., Takatsuka, S., Kitamura, D., Tepper, R.S., Sun, J., and Kaplan, M.H.
  • Journal Title: Science Immunology Volume: 7 Pages: eabi9768
  • DOI: 10.1126/sciimmunol.abi9768
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Protein kinase Cδ is essential for the IgG response against T-cell-independent type 2 antigens and commensal bacteria. (2021)
  • Author(s): Fukao, S., Haniuda, K., Tamaki, H. and Kitamura, D.
  • Journal Title: eLife Volume: 10 Pages: e72116
  • DOI: 10.7554/eLife.72116
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] C/EBPβ induces B-cell acute lymphoblastic leukemia and cooperates with BLNK mutations. (2021)
  • Author(s): Kurata, M., Onishi, I., Takahara, T., Yamazaki, Y., Ishibashi, S., Goitsuka, R., Kitamura, D., Takita, J., Hayashi, Y., Largaesapda, D.A., Kitagawa, M. and Nakamura, T.
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 112 Pages: 4920-4930
  • DOI: 10.1111/cas.15164
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] MicroRNA-directed pathway discovery elucidates an miR-221/222-mediated regulatory circuit in class switch recombination. (2021)
  • Author(s): Wigton, E.J., Mikami, Y., McMonigle, R.J., Castellanos, C.A., Wade-Vallance, A.K., Zhou, S.K., Kageyama, R., Litterman, A., Roy, S., Kitamura, D., Dykhuizen, E.C., Allen, C.D.C., Hu, H., O'Shea, J.J., Ansel, K.M.
  • Journal Title: Journal of Experimental Medicine Volume: 218 Pages: e20201422
  • DOI: 10.1084/jem.20201422
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mechanisms for the regulation of memory B-cell recall responses in mice. (2021)
  • Author(s): Kitamura, D.
  • Journal Title: International Immunology Volume: 33 Pages: 791-796
  • DOI: 10.1093/intimm/dxab042
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Multi-faceted regulation of IgE production and humoral memory formation. (2021)
  • Author(s): Haniuda, K. and Kitamura, D.
  • Journal Title: Allergology International Volume: 70 Pages: 163-168
  • DOI: 10.1016/j.alit.2020.11.002
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Pathogenic antibody production by microbiota in an IgA nephropathy mouse model. (2021)
  • Author(s): 北村大介
  • Organizer: 5th Symposium of the International Immunological Memory and Vaccine Forum
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] IgA腎症におけるIgA自己抗体産生 (2021)
  • Author(s): 北村大介、二瓶義人、東山瑞希、岩崎裕幸、久斗陸、羽生田圭、鈴木祐介
  • Organizer: 第85回日本インターフェロン・サイトカイン学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] B細胞におけるIgE産生制御 (2021)
  • Author(s): 北村大介
  • Organizer: 第7回総合アレルギー講習会
  • Invited
• [Patent(Industrial Property Rights)] IgA腎症に関連する自己抗体 (2021)
  • Inventor(s): 北村大介，鈴木祐介，二瓶義人
  • Industrial Property Rights Holder: 北村大介，鈴木祐介，二瓶義人
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: PCT/JP2021/044409
  • Overseas