2020 Fiscal Year Annual Research Report

Development of Universal Cell Therapy for Hemophilia A 

Research Project

Project/Area Number	20H00531
Research Institution	Nara Medical University
Principal Investigator	嶋緑倫奈良県立医科大学, 医学部, 副学長 (30162663)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	辰巳公平奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70555432) 堀江恭二奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446) 坂田飛鳥奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90528457) 荻原建一奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (50623500) 小田朗永奈良県立医科大学, 医学部, 特任助教 (80547703)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	血友病A / iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / 第VIII因子 / 肝類洞内皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、血友病Aに対するユニバーサル治療としての同種細胞療法の臨床応用実現化を目指し、主に治療用細胞の最適化と移植技術の改善を基盤として、治療効果向上を図ることを目的とするものである。具体的には、１）iPS細胞技術を駆使した、血友病A細胞治療に最適な第VIII因子産生細胞の作製、２）当該細胞から産生される第VIII因子タンパクの機能解析、３）効率的かつ長期的な細胞生着を可能とする移植法の開発（細胞調整法、移植部位、移植手技、移植細胞数、移植回数、移植時期等）、４）長期安全性および異常発生時の移植細胞除去法、についての一連の検討を、主に血友病Aモデルマウスを用いて実施・検証する研究である。初年度は主に、ヒトiPS細胞やヒト間葉系幹細胞からの肝類洞内皮細胞（第VIII因子の産生責任細胞）への分化誘導に取り組み、両細胞ともに、肝類洞内皮細胞マーカーを発現する細胞の分化誘導に成功した。特にヒト間葉系幹細胞については、肝臓発生のシグナル経路に関与するサイトカインや化合物を組合わて添加する検討を重ねた結果、第VIII因子遺伝子の発現増加も確認できた。将来的にはこれらの作製細胞を細胞シート化した上で血友病Aマウスに移植してその治療効果を確認する予定であるが、ヒト細胞を受容させるためには免疫不全のマウスを使用する必要がある。その目的で、CRISPR-Cas9技術を用いて免疫不全background (SCID）の血友病A（F8-KO）マウスの作製に取り組み、初代マウスの作出に成功した。現在これらマウスを繁殖中であり、一定の個体数が揃い次第、順次移植実験に使用してゆく予定である。また、細胞シートを作製する際に使用する温度応答性培養皿についても、肝類洞内皮細胞を含む血管内皮系細胞の機能向上を目的とした改変（培養皿表面加工）にも取り組んでおり、一定の成果が得られつつある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 各種幹細胞の分化誘導による治療用細胞の作製は順調に進んでおり、将来的に細胞移植実験に使用予定の免疫不全血友病Aマウスの作出にも成功した。引き続き２年目以降も申請した計画に従って研究を進めてゆく予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策として、下記の研究に取り組む。１）iPS細胞や間葉系幹細胞から、第VIII因子をさらに高発現する細胞を作製する作業に取り組む。その際には、Lyve1やCD32bといった一般的な肝類洞内皮細胞マーカーの発現も同時に評価することで細胞分化の妥当性を確認する。遺伝子発現のみならず、細胞の免疫染色や培養上清中の第VIII因子抗原量をELISAで定量することで、タンパクレベルでの発現も確認する。さらには、培養上清を用いた凝固アッセイ（凝固一段法、トロンビン生成試験など）を実施することで、分泌された第VIII因子タンパクの機能評価も行う。２）次いで、作製した細胞の細胞シート化に挑戦する。細胞シートは基本的には既存の温度応答性培養皿を用いて作製する予定であるが、その際の播種条件・温度条件などを最適化する。さらには、現在、肝類洞内皮細胞の機能向上を目的とした改良型温度応答性培養皿の開発にも取り組んでおり、その新規培養皿の機能評価も実施する。３）そして、作製した細胞シートの免疫不全血友病Aマウスへの移植実験を開始する。細胞シート移植の比較対照として、作製細胞を経脾的に肝臓に注入移植する実験も並行して行う。細胞シートの移植は、皮下移植や肝表面移植を想定しており、治療効果向上の目的で重層化細胞シートや共培養細胞シートの移植も視野に入れている。移植後、経時的に採血を行い、血漿中の第VIII因子タンパクの抗原量をELISAで、凝固活性を凝固一段法やトロンビン生成法で評価する。また、血管へのレーザー障害により惹起される血栓形成をin vivo imagingで評価する検討も行う。一定期間の経過観察ののち、移植部位の組織学的解析を実施し、また、テールクリッピング試験による出血時間の定量を行うことで、細胞シート移植の治療有効性を総合的に評価する。