2022 Fiscal Year Annual Research Report

Development of Universal Cell Therapy for Hemophilia A 

Research Project

Project/Area Number	20H00531
Research Institution	Nara Medical University
Principal Investigator	嶋緑倫奈良県立医科大学, 医学部, 副学長 (30162663)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	堀江恭二奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446) 辰巳公平奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70555432) 坂田飛鳥奈良県立医科大学, 医学部, 特任助教 (90528457) 小田朗永奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (80547703) 荻原建一奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (50623500)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	血友病A / iPS細胞 / 間葉系幹細胞 / 第VIII因子 / 肝類洞内皮細胞 / 細胞シート / マウス
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、血友病Aに対するユニバーサル治療としての同種細胞療法の臨床応用実現化を目指し、主に治療用細胞の最適化と移植技術の改善を基盤として、治療効果向上を図ることを目的とするものである。具体的には、１）iPS細胞や間葉系幹細胞等の幹細胞技術を駆使した、血友病A細胞治療に最適な第VIII因子産生細胞の作製、２）当該細胞から産生される第VIII因子タンパクの機能解析、３）効率的かつ長期的な細胞生着を可能とする移植法の開発、についての一連の検討を、主に血友病Aモデルマウスを用いて検証する研究である。令和４年度は、ヒト間葉系幹細胞から第VIII因子産生能を有した肝類洞内皮細胞の分化誘導法の確立に成功し、その結果を論文としてまとめた（現在投稿中）。また、その確立したプロトコールを基盤に、ヒトiPS細胞からの肝類洞内皮細胞への分化誘導実験にも取り組み、分化誘導ステップの初期段階における添加物の最適化により、既報を上回る分化誘導効率で肝類洞内皮細胞様細胞に分化せしめるプロトコールの策定に成功し、さらには、その分化細胞からの第VIII因子の分泌も確認した（現在論文準備中）。現在、これら分化細胞からなる細胞シート作製法の開発にもとりくんでいる。その一環で、細胞シート作製に用いる温度応答性培養皿の加工を行っており、具体的には、培養皿表面に、肝類洞内皮細胞の機能向上化が期待できる分子を化学修飾することで、作製細胞シートの高機能化を目指している。令和4年度にすでにこの改良型培養皿の開発には既に成功し、現在論文作成段階にある。作成した細胞シートの免疫不全マウスへの移植実験も既に開始しており、皮下部位のみならず肝臓表面に効率的に細胞シートを生着せしめる手技も確立した。次年度は、細胞シート移植による実際の治療効果についての判定を行っていく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 各種幹細胞（iPS細胞、間葉系幹細胞）の分化誘導による治療用細胞（肝類洞内皮細胞）の作製は順調に進んでいる。特に、間葉系幹細胞からの肝類洞内皮細胞の分化誘導については、これまで世界的にも成功報告例が極めて少なく、まして、第VIII因子の産生能を有した細胞作製の報告例はない。我々が分化誘導して作製した肝類洞内皮細胞は、肝類洞内皮細胞特異的な遺伝子発現やタンパクマーカー発現が認められるのみならず、血管チューブ形成能やLDL取り込み能など、肝類洞内皮細胞の特異的機能も明らかに獲得していることを確認しており、これら研究成果をまとめ論文した（現在査読中）。iPS細胞からの効率的な肝類洞内皮細胞誘導法の確立にも成功し、まもなく論文投稿する予定である。また、細胞シート作成用の培養皿の改良にも成功し、細胞シートのマウスへの移植実験も順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策として、主に、肝類洞内皮細胞の細胞シート化および移植実験の研究に取り組む。細胞シートは基本的には既存の温度応答性培養皿もしくは開発した改良型温度応答性培養皿を用いて作製する予定であるが、その際の播種条件・温度条件などを最適化する。次いで、作製した細胞シートの免疫不全血友病Aマウスへの移植実験を開始する。細胞シート移植の比較対照として、作製細胞を経脾的に肝臓に注入移植する実験も並行して行う。細胞シートの移植は、皮下移植や肝表面移植を想定しており、治療効果向上の目的で重層化細胞シートや共培養細胞シートの移植も視野に入れている。移植後、経時的に採血を行い、血漿中の第VIII因子タンパクの抗原量をELISAで、凝固活性を凝固一段法やトロンビン生成法で評価する。また、血管へのレーザー障害により惹起される血栓形成をin vivo imagingで評価する検討も行う。一定期間の経過観察ののち、移植部位の組織学的解析を実施し、また、テールクリッピング試験による出血時間の定量を行うことで、細胞シート移植の治療有効性を総合的に評価する。