SIK3および新規睡眠制御分子による睡眠制御シグナルカスケードの解明

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20H00567
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 船戸 弘正 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 客員教授 (90363118)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三好 千香 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (60613437) ; 成清 公弥 東邦大学, 医学部, 助教 (70599836) ; 山形 朋子 東邦大学, 医学部, 助教 (90584433)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 睡眠 / 遺伝子改変マウス / リン酸化酵素 / 細胞内シグナル

Outline of Annual Research Achievements

睡眠覚醒制御の実行回路を構成する神経細胞の働きを変化させる細胞内の仕組みは明らかではない。研究代表者らは順遺伝学的アプローチにより新しい睡眠制御分子、特に睡眠要求を調整する役割を持つ分子としてリン酸化酵素SIK3を同定した。Sleepy変異型のSIK3を発現すると睡眠が増大する。睡眠制御におけるSIK3の基質の同定が課題となっていた。培養細胞を用いた、遺伝子発現を指標とするアッセイにより、Sleepy変異型SIK3はヒストン脱アセチル化酵素HDAC4を介した転写抑制に関して機能獲得型の性質を示すことが明らかにされた。Sleepy変異型SIK3を発現するマウスの脳では、HDAC4によってリン酸化を受けるセリン残基のリン酸化レベルが亢進していた。大脳皮質ニューロン核内のHDAC4が減少していた。SIK3によるリン酸化を受けないようにセリン残基をアラニンに置換したHDAC4は培養細胞による検討でSIK3に対して機能的にも抵抗性を獲得する。睡眠に関してSleepy変異型SIK3とアラニン置換HDAC4はどのような相互作用を示すのか明らかにするため、過眠を呈するSleepy変異型SIK3マウスに、アデノ随伴ウイルスを用いてアラニン置換HDAC4を発現させた。その結果、ノンレム睡眠時間およびノンレム睡眠中徐波、つまり睡眠の量と質の両面で概ね正常化した。以上の結果は、SIK3がHDAC4をリン酸化することで核内のHDAC4が減少すること、核内HDAC4が減少するとHDAC4による睡眠促進遺伝子群の転写が低下すること、この結果睡眠が促進するというスキームを示している。HDAC4の阻害薬を脳室内投与するとノンレム睡眠中の徐波成分が減少した。以上の結果の一部をNature誌に発表した。このようにSIK3がHDAC4を基質とし、転写等を介して睡眠覚醒を制御していることを示すことができた。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

年度当初の計画通りに、SIK3によりリン酸化を受けるHDAC4セリン残基(S245)をアラニン残基に置換するとノンレム睡眠時間や睡眠要求の指標であるノンレム睡眠中脳波徐波成分が大幅に減少した。HDAC4floxマウスを用いて興奮性ニューロンのみでHDAC4を欠失させたところノンレム睡眠時間が増加し、ノンレム睡眠中脳波徐波成分が増大した。ルシフェラーゼアッセイにより、Sleepy変異型SIK3はHDAC4を介した転写抑制に関して機能獲得型の性質を示すことが明らかにされた。in vitroの結果に対応するように、SIK3（Sleepy）脳では顕著にS245のリン酸化レベルが亢進し、大脳皮質ニューロン核内のHDAC4が減少していた。ルシフェラーゼアッセイでは、SIK3はHDAC4 S245A蛋白に対して作用を及ぼせない。つまり、HDAC4（S245A）はSIK3に対して抵抗性である。睡眠に関するSIK3とHDAC4の遺伝学的相互作用を明らかにするため、過眠を呈するSleepy変異型SIK3マウスに、アデノ随伴ウイルスを用いてHDAC4（S245A）を発現させたところ、睡眠覚醒は時間と深さの両面で正常化した。以上の結果は、SIK3がHDAC4をリン酸化することで核内のHDAC4を減少させ、核内HDAC4による睡眠促進遺伝子群の転写が低下することで睡眠が促進するというスキームを支持する。HDAC4の阻害薬を脳室内投与するとノンレム睡眠中の徐波成分が減少した。北京生命科学研究所Liu教授との共同研究により、トランスクリプトーム解析やChIP-seqを用いて標的遺伝子の同定も進展した。以上の結果の一部をNature誌に発表した。このようにSIK3がHDAC4を基質として転写等を介して睡眠覚醒を制御していることを示すことができ、計画を超える進展が得られた。

Strategy for Future Research Activity

HDAC４floxマウスを用いて、Creドライバーマウスやアデノ随伴ウイルスを用いて睡眠要求を司るニューロンタイプをさらに限定していく。SIK3-HDAC4経路による個体レベルの睡眠制御機構を明らかにするために、脳部位特異的にSIK3下流シグナルや標的遺伝子を改変させて睡眠恒常性責任神経集団の活動性の変化を検討する。他のクラスII　HDACを用いた検討も進める。アデノ随伴ウイルスを用いた候補遺伝子のノックダウンや阻害剤を用いた検討を行い、異なるタイムスケールでの効果を検討する。異なる睡眠要求水準での脳部位ごとの遺伝子発現を検討するためRNA-seqまたはシングル核RNA-seqを実施し、睡眠恒常性制御の分子的基盤となる分子群とのその発現機構変化を検討する。

Research Products

• [Journal Article] SIK3-HDAC4 in the suprachiasmatic nucleus regulates the timing of arousal at the dark onset and circadian period in mice (2023)
  • Author(s): Asano Fuyuki、Kim Staci J.、Fujiyama Tomoyuki、Miyoshi Chika、Hotta-Hirashima Noriko、Asama Nodoka、Iwasaki Kanako、Kakizaki Miyo、Mizuno Seiya、Mieda Michihiro、Sugiyama Fumihiro、Takahashi Satoru、Shi Shoi、Hirano Arisa、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 120 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1073/pnas.2218209120
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] D1- and D2-type dopamine receptors are immunolocalized in pial and layer I astrocytes in the rat cerebral cortex (2023)
  • Author(s): Oda Satoko、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Neuroanatomy Volume: 17 Pages: 1-12
  • DOI: 10.3389/fnana.2023.1111008
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A signalling pathway for transcriptional regulation of sleep amount in mice (2022)
  • Author(s): Zhou Rui、Wang Guodong、Li Qi、Wu Kejia、Sun Quanzhi、Guo Ying、Wu Chongyang、Chen Zhiyu、Cai Tao、Li Bin、Wang Fengchao、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi、Zhang Eric Erquan、Liu Qinghua
  • Journal Title: Nature Volume: 612 Pages: 519～527
  • DOI: 10.1038/s41586-022-05510-6
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth (2022)
  • Author(s): Kim Staci J.、Hotta-Hirashima Noriko、Fujiyama Tomoyuki、Mizuno Seiya、Miyazaki Shinichi、Tsuneoka Yousuke、Sugiyama Fumihiro、Takahashi Satoru、Hayashi Yu、Muratani Masafumi、Liu Qinghua、Miyoshi Chika、Yanagisawa Masashi、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Nature Volume: 612 Pages: 512～518
  • DOI: 10.1038/s41586-022-05450-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Fluorescence quenching by high-power LEDs for highly sensitive fluorescence in situ hybridization (2022)
  • Author(s): Tsuneoka Yousuke、Atsumi Yusuke、Makanae Aki、Yashiro Mitsuru、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Molecular Neuroscience Volume: 15 Pages: 1-15
  • DOI: 10.3389/fnmol.2022.976349
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] IκBζ controls IL-17-triggered gene expression program in intestinal epithelial cells that restricts colonization of SFB and prevents Th17-associated pathologies (2022)
  • Author(s): Yamazaki Soh、Inohara Naohiro、Ohmuraya Masaki、Tsuneoka Yousuke、Yagita Hideo、Katagiri Takaharu、Nishina Takashi、Mikami Tetuo、Funato Hiromasa、Araki Kimi、Nakano Hiroyasu
  • Journal Title: Mucosal Immunology Volume: 15 Pages: 1321～1337
  • DOI: 10.1038/s41385-022-00554-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] OX2R-selective orexin agonism is sufficient to ameliorate cataplexy and sleep/wake fragmentation without inducing drug-seeking behavior in mouse model of narcolepsy (2022)
  • Author(s): Yamamoto Hikari、Nagumo Yasuyuki、Ishikawa Yukiko、Irukayama-Tomobe Yoko、Namekawa Yukiko、Nemoto Tsuyoshi、Tanaka Hiromu、Takahashi Genki、Tokuda Akihisa、Saitoh Tsuyoshi、Nagase Hiroshi、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 17 Pages: e0271901
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0271901
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hunt for mammalian sleep-regulating genes (2022)
  • Author(s): Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: Brain Science Advances Volume: 8 Pages: 173～182
  • DOI: 10.26599/BSA.2022.9050012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mice Lacking Cerebellar Cortex and Related Structures Show a Decrease in Slow-Wave Activity With Normal Non-REM Sleep Amount and Sleep Homeostasis (2022)
  • Author(s): Fujiyama Tomoyuki、Takenaka Henri、Asano Fuyuki、Miyanishi Kazuya、Hotta-Hirashima Noriko、Ishikawa Yukiko、Kanno Satomi、Seoane-Collazo Patricia、Miwa Hideki、Hoshino Mikio、Yanagisawa Masashi、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Behavioral Neuroscience Volume: 16 Pages: 1-12
  • DOI: 10.3389/fnbeh.2022.910461
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Metabolomic and pharmacologic analyses of brain substances associated with sleep pressure in mice (2022)
  • Author(s): Suzuki-Abe Haruka、Sonomura Kazuhiro、Nakata Shinya、Miyanishi Kazuya、Mahmoud Asmaa、Hotta-Hirashima Noriko、Miyoshi Chika、Sato Taka-Aki、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: Neuroscience Research Volume: 177 Pages: 16～24
  • DOI: 10.1016/j.neures.2021.11.008
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Branched HCR法によって明らかになったマウス脳内オレキシン受容体mRNAの分布 (2023)
  • Author(s): 恒岡洋右, 船戸弘正
  • Organizer: 日本解剖学会
• [Presentation] 睡眠量の規定における出生後の神経細胞での転写因子TFAP2Bの役割 (2023)
  • Author(s): 中井 彩加 、柏木 光昭、藤山 知之、岩崎 加奈子、船戸 弘正、柳沢 正史、櫻井 武、林 悠
  • Organizer: 第100回日本生理学会
• [Presentation] Kinase signaling pathway regulating non-REM sleep (2023)
  • Author(s): 船戸弘正
  • Organizer: 第100回日本生理学会
• [Presentation] Social buffering of isolation by somatosensory stimulation in mouse pups (2022)
  • Author(s): Sachine Yoshida, Hiromasa Funato
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] Sik3 regulates circadian rhythms and sleep need through distinct neurons and brain regions. (2022)
  • Author(s): Fuyuki Asano, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Tomohiro Kitazono, Staci J. Kim, Kanako Iwasaki, Noriko Hotta-Hirashima, Miyo Kakizaki, Aya Ikkyu, Satomi Kanno, Shinya Nakata, Nodoka Asama, Takumi Tsukamoto, Arisa Hirano, Seiya Mizuno, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] Sleep/wake behavior of mice lacking PKA phosphorylation sites in SIK3 (2022)
  • Author(s): Minjeong Park, Takato Honda, Kanako Iwasaki, Chika Miyoshi, Tomoyuki Fujiyama, Miyo Kakizaki, Aya Ikkyu, Seiya Mizuno, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] Involvement of microglia in sleep/wake regulation in baseline conditions and under acute social defeat stress in mice (2022)
  • Author(s): Kazuya Miyanishi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] SIK3 kinase activity has a crucial role in sleep homeostatic regulation (2022)
  • Author(s): Shinya Nakata, Haruna Abe-Komiya, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Aya Ikkyu, Fuyuki Asano, Kanako Iwasaki, Seiya Mizuno, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] Regulation of sleep amount by SIK3 in hypothalamic nuclei (2022)
  • Author(s): Kanako Iwasaki, Tomoyuki Fujiyama, Shinya Nakata, Minjeong Park, Chika Miyoshi, Noriko Hotta-Hirashima, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Yukiko Ishikawa, Fumihiro Sugiyama, Seiya Mizuno, Manabu Abe, Kenji Sakimura, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
• [Presentation] 高感度超多重ISH法から観る内側視索前野のオス性行動における機能 (2022)
  • Author(s): 恒岡洋右、船戸弘正
  • Organizer: 第48回日本神経内分泌学会
• [Presentation] Neural ensembles activities underlying consolation-like behavior in mice (2022)
  • Author(s): Ryo Saito, Deependra Kumar, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa, Aiba A.
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] Molecular mechanisms for sleep/wake regulation mediated by SIK3 kinase activity (2022)
  • Author(s): Shinya Nakata, Haruna Abe-Komiya, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Aya Ikkyu, Fuyuki Asano, Seiya Mizuno, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] Involvement of microglia in sleep/wake regulation in baseline conditions and under acute social defeat stress in mice (2022)
  • Author(s): Kazuya Miyanishi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] Sleep/wake behavior of mice lacking PKA phosphorylation site in SIK3 (2022)
  • Author(s): Minjeong Park, Takato Honda, Chika Miyoshi, Tomoyuki Fujiyama, Miyo Kakizaki, Aya Ikkyu, Seiya Mizuno, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] Changes in sleep/wake by acute disruption in Hdac4 signaling (2022)
  • Author(s): Staci J. Kim, Shinya Nakata, Nodoka Aasama, Asmaa Elhosainy, Noriko Hotta-Hirashima, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Satomi Kanno, Tomoyuki Fujiyama, Seiya Mizuno, Satoru Takahashi, Chika Miyoshi, Hiromasa Funato, Masasyi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] Neuroanatomical analysis of how the gain of function mutation in Sik3 increases sleep (2022)
  • Author(s): Kanako Iwasaki, Tomoyuki Fujiyama, Shinya Nakata, Minjeong Park, Chika Miyoshi, Noriko Hotta-Hirashima, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Yukiko Ishikawa, Fumihiro Sugiyama, Seiya Mizuno, Manabu Abe, Kenji Sakimura, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会
• [Presentation] The role of Sleepy2 family in sleep/wake regulation in mice (2022)
  • Author(s): Takumi Tsukamoto, Staci J. Kim, Nodoka Asama, Fuyuki Asano, Tomoyuki Fujiyama, Aya Ikkyu, Noriko Hotta-Hirashima, Kumi Ebihara, Chika Miyoshi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: 日本神経学学会