2020 Fiscal Year Annual Research Report
Resurrection of ancestral aminoacyl tRNA synthetase and stepwise construction of ancestral translation system
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20H02018
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
横堀 伸一 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (40291702)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
時下 進一 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (60266898)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | tRNA / 祖先配列復元 / 遺伝暗号 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
IleRSとValRSの共通祖先であるIV-Ancが現生生物のIleRSやValRSよりもアミノ酸に対する特異性が低いことが、アミノアシル化反応によって生成されるピロリン酸をリン酸に分解して定量する手法によって示唆されている。しかし、この手法は、直接アミノアシルtRNAを検出しているわけではない。そこで、タンパク質中で用いられるアミノ酸以外のアミノ酸を含む種々のアミノ酸のtRNAへの結合を直接検出するため、アミノアシル化したtRNAを直接酸性ゲル電気泳動法によって、アミノアシル化していないtRNAと分離し、Northern hybridization法で検出する実験手法を検討した。まず、高度好熱菌Thermus thermophilus ValRSをモデルとし、T. thermophilus tRNAのin vitro転写物、各種アミノ酸を基質として実験の条件検討を行い、tRNAに対する特異性を本手法で明らかにできることを確認した。また、アミノ酸に対する特異性は、酵素濃度に対するアミノアシル化tRNA量の変化で定量することが可能であることが示唆された。さらに、IV-Ancについても、アミノアシル化tRNAの生成を検出できるという結果を得た。これに基づき、非天然アミノ酸を含めて、様々なアミノ酸とその類似物質を基質として祖先ARSのアミノアシル化活性を検討していく。
また、アミノアシル化だけではなく、実際の翻訳系の中でもこれらの祖先ARSが機能するのか検討するため、LeuRS、IleRS、またはValRSを除いた再構成型無細胞タンパク質合成系に、IleCom、ValCom、またはIV-Ancを加えてタンパク質合成が行われるか検討することとした。今後、基質（tRNA、アミノ酸）の種類と濃度、酵素濃度などの検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アミノアシル化反応によって生成されるピロリン酸をリン酸に分解して定量する手法によって、IleRSとValRSの共通祖先であるIV-Ancが現生生物のIleRSやValRSよりもアミノ酸に対する特異性が低いことが示唆されている。そこで、タンパク質中で用いられるアミノ酸以外のアミノ酸を含む種々のアミノ酸のtRNAへの結合を直接検出するため、非放射性アミノ酸を使用する実験系を試みることとした。そのため、アミノアシル化したtRNAを直接酸性ゲル電気泳動法とNorthern hybridization法で検出する実験手法を検討した。まず、高度好熱菌Thermus thermophilus ValRSをモデルとし、T. thermophilus tRNAのin vitro転写物、各種アミノ酸を基質として実験の条件検討を行い、tRNAに対する特異性を本手法で明らかにできることを確認した。また、アミノ酸に対する特異性は、酵素濃度に対するアミノアシル化tRNA量の変化で定量することが可能であることが示唆された。さらに、IV-Ancについても、アミノアシル化tRNAの生成を検出できるという結果を得た。非天然アミノ酸を含めて、様々なアミノ酸とその類似物質を基質として祖先ARSのアミノアシル化活性を検討可能となった。
また、LeuRS、IleRS、またはValRSを除いた再構成型無細胞タンパク質合成系に、IleCom、ValCom、またはIV-Ancを加えてタンパク質合成が行われるか検討を開始した。今後、基質（tRNA、アミノ酸）濃度、酵素濃度などの検討を行う。
さらに、新規にLeuRSの共通祖先LeuComの祖先配列推定を行い、発現用遺伝子を設計した。
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| Strategy for Future Research Activity |
酸性ゲル電気泳動法とNorthern hybridization法でアミノアシルtRNAを検出する手法を用いて、祖先ARSであるIleCom、ValCom、並びにIV-Ancのアミノ酸、並びにtRNA特異性を検討する。T. thermophilus並びに全生物の最後の共通祖先（Commonote)の配列を復元した祖先tRNAのin vitro転写物を基質とし、非タンパク質アミノ酸も基質としての検証対象とする。
上記と並行して、LeuComの発現、精製、基質特異性の検討を行う。また、IleRS、ValRS、LeuRSにMetRSを加えた系統樹を作成し、MetRSをアウトグループとしてIleRS、ValRS、LeuRSの共通祖先LIV-Ancの配列を推定し、発現用プラスミドを作成し、その発現、精製、基質特異性の検討を行う。
また、引き続き、LeuRS、IleRS、またはValRSを除いた再構成型無細胞タンパク質合成系に、IleCom、ValCom、またはIV-Ancを加えてタンパク質合成が行われるか検討する。LeuCom、LIV-Ancの発現、精製の進展によっては、これらの祖先ARSについても合わせて検討する。
さらに、無細胞タンパク質合成系以外での祖先ARSの翻訳系での機能を検討するため、祖先ARSによる大腸菌Eschechira coliのARSの置き換えを検討する。まず、ValComを大腸菌のValRSに置き換えることが可能か、大腸菌のValRS遺伝子についての温度感受性株を用いたValRSのValComへの置換を検討する。
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