2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of Microdroplet-based Electroporation System for Genome Editing
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20H02045
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
柴田 隆行 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10235575)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
沼野 利佳 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30462716)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 遺伝子導入技術 / 電気穿孔法 / iPS細胞 / ゲノム編集 / マイクロ流体デバイス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、マイクロ液滴内（極微小反応場）に単一細胞と初期化遺伝子を封入し、同一のマイクロ流路内で連続的に電気穿孔を行う安全かつ高効率な遺伝子導入技術（オンチップ遺伝子情報改変システム）の確立を最終的な目標としている。本申請課題では、基礎研究として、①提案するマイクロ液滴電気穿孔法の一連のプロセス（細胞整列→液滴形成→電気穿孔）における微小空間内での物理現象の解明と、応用研究として、②本提案技術をiPS細胞の作製技術として適用し、自動化量産技術としての有効性と安全性を実証することを目指している。令和3年度に得られた成果は以下の通りである。
（1）マイクロ流路（遺伝子改変チップ）を用いて、双極性三角波電圧印加条件下（周波数10kHz、電圧±10V）で、ヒト胎児腎細胞（HEK293細胞）に緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードしたプラスミドDNAの導入実験を行った。その結果、最大で約40%の遺伝子発現確率が得られることを実証した（令和2年度の実績：5%）。しかし、細胞生存率が20%程度と低く、遺伝子発現確率と生存率を高いレベルで実現するための電気穿孔条件の最適化を図る。
（2）油中液滴からの細胞回収率の改善と作業効率の向上を図るために、液滴を用いない「単相流」（細胞懸濁液のみをマイクロ流路内に導入して電気穿孔を行う）を用いた新規の手法を提案した。その結果、細胞回収数は処理時間当たり700個/minとなり、液滴を形成するプロセス（60個/min）に対して10倍以上の細胞数を次工程の培養に供することが可能となった。これによって、作業工程が簡略化でき、かつオイルフリーとなることで細胞毒性に及ぼす影響を低減できることが期待できる。今後は、遺伝子発現確率および生存率を評価する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイクロ液滴電気穿孔プロセスにおいて、双極性三角波電圧（周波数10kHz以上）を適用することで、当初計画の直流電圧印加条件下での問題点であった電極への付着物（主にDNA分子）の堆積、電極の溶出および電気分解による気泡の発生の問題点を解決し、長時間安定した電気穿孔処理が可能となった。その結果、ヒト胎児腎細胞株（HEK293細胞）に導入した緑色蛍光タンパク質（GFP）コードプラスミドDNAの遺伝子発現確率40%を達成し、本提案プロセスの有効性を実証した。また、研究分担者（沼野）は、従来（独自技術）の液滴電気穿孔法（液滴直径1.8mm程度）によるiPS細胞作製の可能性を実証しており、細胞培養条件の最適化ならびにiPS細胞の同定手法を確立しており、本申請課題のマイクロ流路（遺伝子改変チップ）を用いた電気穿孔プロセスでのiPS細胞作製実験の準備が整った段階にある。さらに、新規な電気穿孔プロセスとして、細胞懸濁液のみの単相流（オイルフリー）での電気穿孔の可能性を見出し、細胞回収率の大幅な向上（従来比10倍）を実現したことで、iPS細胞量産技術としての可能性が広がった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度に得られた結果に基づき、以下の研究実施計画にしたがって研究開発を実施する。
（1）液滴電気穿孔において、高い遺伝子導入確率が達成できたものの、細胞生存率が低いという問題があった。双極性電圧の印加回数の影響を精査し、電気穿孔条件の最適化を図る。（2）細胞回収率および作業効率が高い新規な単相流（オイルフリー）電気穿孔プロセスにおける遺伝子発現確率および細胞生存率を評価し、量産技術としての可能性を検証する。また、単相流に適したマイクロ流路デザインの最適化を図る。（3）Bリンパ芽球様細胞株（LCL：B細胞を不死化した細胞株）への山中因子（初期化遺伝子）の導入実験を行い、iPS細胞作製の可能性を検証する。また、従来（独自技術）の液滴電気穿孔法（液滴直径1.8mm程度）によるiPS細胞の作製および培養条件の最適化についても引き続き検討を行う。（4）マイクロ流路内での細胞整列技術を検討する。研究代表者が考案した非対称マイクロミキサを利用し、流線に沿った細胞整列の可能性を検討する。また、決定論的横置換法（DLD）を併用し、単離した細胞のみを選別することで、細胞整列の精度と再現性の向上を図る。（5）前年度に考案したマイクロウェルアレイ内で電気穿孔を行うマイクロウェルアレイ型デジタルエレクトロポレーション（dEP）技術の可能性を引き続き検証する。
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