2022 Fiscal Year Annual Research Report

Development of Microdroplet-based Electroporation System for Genome Editing

Research Project

Project/Area Number	20H02045
Research Institution	Toyohashi University of Technology
Principal Investigator	柴田隆行豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (10235575)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	沼野利佳豊橋技術科学大学, エレクトロニクス先端融合研究所, 教授 (30462716)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	遺伝子導入技術 / 電気穿孔法 / iPS細胞 / ゲノム編集 / マイクロ流体デバイス
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、マイクロ液滴内（極微小反応場）に単一細胞と初期化遺伝子を封入し、同一のマイクロ流路内で連続的に電気穿孔を行う安全かつ高効率な遺伝子導入技術（オンチップ遺伝子情報改変システム）の確立を最終的な目標としている。本申請課題では、基礎研究として、①提案するマイクロ液滴電気穿孔法の一連のプロセス（細胞整列→液滴形成→電気穿孔）における微小空間内での物理現象の解明と、応用研究として、②本提案技術をiPS細胞の作製技術として適用し、自動化量産技術としての有効性と安全性を実証することを目指している。令和3年度に得られた成果は以下の通りである。（1）マイクロ流路を用いた電気穿孔プロセス（流路型電気穿孔装置）において、これまで検討してきた「液滴・直流」から「単相流・交流」へと方針を大きく転換した。本提案の単相流の技術は、オイルフリーでの電気穿孔が可能であるため、細胞回収率（～100%）、作業効率、実験の再現性などに優れている。本提案技術を適用し、Bリンパ芽球様細胞株（LCL：B細胞を不死化した細胞株）への山中因子（初期化遺伝子）の導入実験を行った結果、0.048%の樹立効率でiPS細胞の作製に成功した。（2）新規に考案したマイクロウェルアレイ内で電気穿孔を行うマイクロウェルアレイ型デジタルエレクトロポレーション（dEP）技術の可能性を引き続き検討した。マイクロウェル内での細胞への電気刺激の付与の可能性を実証した。また、マイクロウェル内の微小空間においても培養液の供給によって培養環境が実現できることを明らかにした。さらに、決定論的横置換法（DLD法）を用いた細胞塊と単一細胞の分離手法を検討し、95%以上の確立で単一細胞の分離を実現した。
Research Progress Status	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。